Thesis
Estudio molecular y funcional del factor de corte del pre-mRNA, EhCF Im25 de entamoeba histolytica
Fecha
2008-09-25Registro en:
Fernández Retana, Jorge. (2007). Estudio molecular y funcional del factor de corte del pre-mRNA, EhCF Im25 de entamoeba histolytica (Doctorado en Ciencias Biomedicina Molecular). Instituto Politécnico Nacional, Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía, México.
Autor
Fernández Retana, Jorge
Institución
Resumen
RESUMEN: En eucariotes, la regulación de la expresión genica tiene multiples niveles implicados en el inicio de la transcripción, elongación y terminación. Es así que la transcripción del DNA produce un mRNA inmaduro (pre-mRNA) el cual sufre modificaciones post-transcripcionles, como es la adición de un cap en el extremo 5’, el splicing y la poliadenilación en el extremo 3’ La poliadenilación del pre-mRNA requiere de dos reacciones acopladas, el corte y poliadenilación, atraves de la interacción con el extremo carboxilo terminal de la RNA polimerasa II. Ambos procesos dependen de factores trans-activadores que interactúan coordinadamente con secuencias cis específicas en el 3’ UTR para sintetizar un tallo de poli(A), el cual se ha demostrado que es esencial para el transporte nuclear, estabilidad y eficiencia de la traducción. Recientemente identificamos la maquinaría para el corte y poliadenilación en Entamoeba histolytica, el parásito protozoario responsable de la amibiasis humana. En el presente trabajo nos enfocamos en la proteína EhCF Im25 el homologo de la subunidad CFIm-25 del factor de corte en humano, que esta involucrado el proceso en el cortre del extremo 3’ del RNA. Interesantemente E. histolytica posee el gen EhCF Im-mut que al parecer es resultado de la duplicación del gen EhCF Im25 asociado a mutaciones. Un analisis in silico demostró que EhCF Im25 (31 kDa) comparte 25-38% de identidad con proteínas homólogas. También presenta un dominio central Nudix descrito en distintas enzimas catalíticas, además de una señal de localización nuclear. El gen EhCF Im25 fue amplificado por PCR y clonado en el vector pRSET-A. La proteína recombinate rEhCF Im25 expresada en bacterias fue usada para generar anti-cuerpos específicos en conejo, los cuales reconocen en una prueba de Western Blot una banda de 55 kDa en extractos nucleares y citoplásmicos de trofozoítos. Nuestros resultados sugieren que EhCF Im25 puede interactuar con otra proteína mediante una unión que no puede se desahace bajo condiciones reductoras y condiciones electroforeticas desnaturalizantes. Finalmente, un ensayo preliminar de retardamiento demuestro que EhCF Im25 se une a un sustratio de RNA. ABSTRACT: In eukaryotes, genetic expression regulation takes place at multiple levels including transcription initiation, elongation and termination. DNA transcription produces immature mRNA (pre-mRNA) that undergoes post-transcriptional modifications, such as 5' end capping, splicing and 3' end polyadenylation. Pre-mRNA polyadenylation requires two coupled reactions, cleavage and polyadenylation, in a coordinated way through interaction with the carboxyl terminal domain of RNA polymerase II. Both processes depend on trans-acting factors that coordinately interact with specific cis-sequences in 3' UTR to synthesize the poly(A) tail that has been shown to be essential for mRNA nuclear export, stability and translation efficiency. Recently, we identified the cleavage and polyadenylation machinery of Entamoeba histolytica, the protozoan parasite responsible for human amoebiasis. Here we focused on the EhCF Im25 protein, the homologue of the human CFIm-25 factor that is thought to be involved in RNA 3' end cleavage. Interestingly, E. histolytica also possesses the EhCF Im-mut gene that seems to result from EhCF Im25 gene duplication associated with mutations events. In silico analysis showed that EhCF Im25 (31 kDa) shares 28–35% identity with homologous eukaryotic proteins. Moreover, it has the central Nudix domain described in distinct catalytic enzymes and a nuclear localization signal. The EhCF Im25 gene was PCR-amplified and cloned into the pRSET-A vector. The recombinant rEhCF Im25 protein expressed in bacteria was used to generate specific rabbit antibodies, which recognized a 55 kDa band in nuclear and cytoplasmic extracts of trophozoites in Western Blot assays. Our results suggested that EhCF Im25 could be interacting with another protein through a biochemical link that could not be disrupted under reducing and denaturing electrophoresis conditions. Finally, a preliminary RNA electrophoretic mobility shift assay showed that EhCF Im25 binds to RNA substrate.
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