Rational design of the resveratrol O-methyltransferase for the biological synthesis of pinostilbene

Abstract

Stilbenes are phenolic compounds derived from the secondary metabolism of plants that participate in their defense mechanisms. Resveratrol is one of the most studied stilbenoids due to its health-promoting properties but undergoes rapid metabolization and has low bioavailability. It has been reported that methylated derivates have increased stability and bioavailability and, therefore, a higher added value and industrial attractiveness. Few studies have addressed the biosynthesis of the commercially valuable mono-methylated resveratrol derivative, pinostilbene, because most of the characterized O-methyltransferases (OMTs) have low efficiency in catalyzing the mono-methylation of resveratrol, favoring its di-methylation, and yielding pterostilbene as a principal product. Here we report a rational engineering technique to modify to substrate preference of the resveratrol OMT from Vitis vinifera (VvROMT) and reach pinostilbene as a principal product. Firstly, we constructed a three-dimensional protein model in a closed and catalytically competent conformation and characterized the VvROMT substrate binding site. Then, by applying different in silico approaches, we identified critical binding site residues for VvROMT enzymatic activity. Later, we rationally designed eight variants by comparing the binding site residues of our model with other stilbene OMTs. We successfully modified the native substrate selectivity of VvROMT The F311W/L117F variant generated up to 67% conversion to pinostilbene after 24 h of reaction, whereas no pinostilbene was detected with the wildtype enzyme, yielding 44.2% conversion to pterostilbene. We successfully modified the native substrate selectivity of VvROMT from a sequential two-step methylation reaction to obtain pinostilbene as a principal product. These variants could be potentially integrated into a synthetic pathway for sustainable production of pinostilbene in an existing metabolically engineered system. Furthermore, our results suggest that the VvROMT binding site can be tailor-made to diversify methylated stilbenes production and other related phenolic compounds industrially competitive and with improved health-promoting and nutritional properties.

Los estilbenos son compuestos fenólicos sintetizados por plantas y cumplen un rol fundamental en su respuesta defensiva. El resveratrol es uno de los estilbenos más estudiados debido a sus propiedades benéficas para la salud humana. Sin embargo, al ser consumido, es metabolizado rápidamente mostrando una baja biodisponibilidad. Se ha reportado que derivados metilados de resveratrol presentan una mayor estabilidad y biodisponibilidad, y por tanto un mayor atractivo industrial. Existen escasos estudios que aborden la biosíntesis de pinoestilbeno, resveratrol mono-metilado, de elevado valor comercial. Principalmente porque las enzimas caracterizadas con actividad O- metiltransferasa (OMT), presentan una baja eficiencia en catalizar la mono-metilación de resveratrol, favoreciendo la di-metilación de este compuesto en una reacción secuencial de dos pasos, obteniendo pteroestilbeno como principal producto. En esta investigación, se utilizó una estrategia de Ingeniería racional de proteínas para modificar la preferencia de sustrato de la enzima resveratrol O-metiltransferasa de Vitis vinifera (VvROMT) y obtener pinoestilbeno como principal producto de la reacción. En primera instancia, se construyó un modelo tridimensional de VvROMT y se caracterizó su sitio activo mediante diferentes herramientas in silico, identificando residuos críticos para su actividad enzimática. Luego, mediante un diseño racional, basado en estructura y alineamiento de secuencias con otras estilbeno OMTs, se generaron ocho variantes. La variante F311W/L117F generó hasta un 67% de conversión a pinoestilbeno después de 24 h de reacción mientras que con la enzima nativa no se detectó pinoestilbeno y se obtuvo un 44,2% de conversión a pteroestilbeno. Por otro lado, la variante L117F presentó una mejora global en su actividad específica. Logramos modificar exitosamente la preferencia de sustrato de VvROMT, pasando desde una di-metilación secuencial a mono-metilar resveratrol y obtener pinoestilbeno como principal producto. Estas variantes pueden ser incluidas en rutas sintéticas existentes para la biosíntesis sustentable de pinoestilbeno en sistemas recombinantes. Nuestros resultados sugieren que el sitio activo de VvROMT puede ser ingenierizado para diversificar la producción de estilbenos y otros compuestos fenólicos industrialmente competitivos y beneficiosos para la salud y nutrición humana.