Tesis Doctorado
Estructuras de RNA y su impacto sobre el inicio de la traducción del mRNA genómico de HIV-1 y del SmRNA de ANDV.
RNA structures and their impact on the translation initiation from the the HIV-1 genomic mRNA and the ANDV SmRNA.
Fecha
2019Autor
López Lastra, Marcelo Andrés
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
Institución
Resumen
La síntesis de proteínas es el proceso por el cual la información contenida en un RNA mensajero (mRNA) es decodificada para sintetizar la correspondiente cadena polipeptídica. El proceso de síntesis de proteínas se divide en 4 etapas principales: iniciación, elongación, terminación y reciclaje de ribosomas. El inicio de la síntesis de proteínas, la cual es la etapa más regulada de la traducción, comprende el reclutamiento de los factores de inicio de la traducción y de la subunidad 40S ribosomal sobre el mRNA a ser traducido, el proceso de búsqueda del codón de inicio o scanning, y el ensamblaje y posicionamiento del ribosoma 80S sobre el codón de inicio. En el mRNA existen estructuras canónicas necesarias para un proceso eficiente de inicio de la traducción, tales como la estructura cap en el extremo 5’, y la cola poliadenilada (poly(A)) en el extremo 3’ de éste. Dichas estructuras permiten el reclutamiento de los factores de inicio, así como la circularización no covalente del mRNA. A su vez, las regiones 5’ y 3’ no traducidas (UTRs) del mRNA contribuyen en la regulación del proceso de inicio, modulando la eficiencia del reclutamiento de la maquinaria traduccional. En este respecto, las estructuras de RNA presentes en las regiones UTR son moduladores importantes del proceso de inicio de la síntesis de proteínas. Algunos mRNAs de origen viral utilizan mecanismos alternativos para reclutar los complejos de inicio de la traducción, otorgándoles una ventaja por sobre los demás mRNAs dentro de la célula. Parte de estos mecanismos no canónico se basan en la presencia de estructuras de RNA en las regiones UTR del mRNA, las cuales pueden mediar la síntesis de proteínas de forma independiente de la estructura cap o de la cola poly(A). Para ahondar en el conocimiento de los mecanismos de regulación del inicio de la traducción no canónico, en este trabajo de tesis, se eligieron dos modelos de mRNAs virales, los cuales permiten caracterizar por un lado el inicio de la síntesis de proteínas cap-independiente, y por otro, el inicio de la traducción poly(A) independiente.
El primer modelo utilizado fue el mRNA completo del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HIV-1). Este mRNA viral posee en su región 5’UTR un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Para este modelo, se determinó el funcionamiento del elemento HIV-1 IRES en diferentes tipos celulares. Se estableció que este IRES es de naturaleza modular, diferenciándose así de los IRES de origen viral. Se determinó además que el elemento HIV-1 IRES no requiere del proceso de scanning para iniciar la síntesis de proteínas, reclutando los complejos de inicio directamente sobre el codón de inicio.
El segundo modelo estudiado correspondió al mRNA del segmento S (SmRNA) del Orthohantavirus Andes (ANDV). Este mRNA viral posee una estructura 5’-cap, pero carece de cola poly(A). A pesar de esto, el SmRNA es traducido, dando origen a las proteínas virales N y NSs. En este trabajo se caracterizaron las estructuras secundarias de RNA presentes en la región 5’ y 3’ UTR del SmRNA de ANDV mediante la estrategia de SHAPE. Se determinó la estructura de la región 5’UTR y se estableció que las estructuras de RNA presentes en ella regulan el inicio de la traducción del SmRNA. Para la región 3’UTR del SmRNA, se caracterizó las estructuras de RNA existentes, sin embargo, no fue posible asignan una estructura única a esta región puesto que los resultados sugieren que más bien se comportaría como un elemento dinámico.
En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis permiten ahondar en el entendimiento de la regulación del proceso de inicio de la síntesis de proteínas no canónico en modelos de mRNAs virales. Protein synthesis is the process by which the information encoded in a messenger RNA (mRNA) is decoded to synthesize the corresponding polypeptide chain. The protein synthesis process is divided in 4 steps: initiation, elongation, termination and recycling of ribosomes. The initiation step of the protein synthesis, which is the most regulated step, comprises the recruitment of the initiation factors and the 40S ribosomal subunit to the mRNA, the search for an adequate start codon (scanning), and the assembly and positioning of the 80S ribosome on the start codon. There are canonical structures in the mRNA, necessary for an efficient translation initiation process, such as the 5’end cap structure, and the polyadenylated tail (poly(A)) in the 3’ end of the mRNA. Both structures allow the recruitment of the initiation factors, and the non-covalent circularization of the mRNA. Likewise, the 5’ and 3’ untranslated regions (UTRs) of the mRNA contribute to the regulation of the initiation process, modulating the efficiency of the recruitment of the translational machinery. In this respect, the RNA structures present in the UTR regions are key modulators of the process of translation initiation. There are mRNAs of viral origin that use alternative mechanisms to recruit the translation initiation complexes, giving them an advantage over other mRNAs inside the cell. Part of these non-canonical mechanisms is based on the presence of RNA structures in the UTR regions of their mRNAs, which can mediate protein synthesis independently of the presence of the cap or the poly(A) structures. In order to deepen the knowledge of the mechanisms that regulate the non-canonical translation initiation process, in this thesis two viral mRNAs models were chosen, which will allow on one side to characterize the cap-independent initiation process, and on the other side, the poly(A)-independent initiation process.
The first model used was the full-length mRNA of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). This viral mRNA harbors an internal ribosome entry site (IRES) in its 5’UTR. For this model, the functionality of the HIV-1 IRES element was determined in different cell types. Was established that this IRES element is modular in nature, rendering it different from other viral IRES elements. It was also determined that the HIV-1 IRES element does not require the scanning process to initiate the protein synthesis, being able to recruit the initiation complexes directly on the initiation codon.
The second model studied corresponded to the mRNA of the S segment (SmRNA) of the Orthohantavirus Andes (ANDV). This viral mRNA have a 5’-cap structure but lacks a poly(A) tail. Despite this, the SmRNA is translated, giving rise to the viral proteins N and NSs. In this thesis, the RNA secondary structures located on the 5’ and 3’UTR regions of the SmRNA were characterized, using the SHAPE strategy. The secondary structure of the 5’UTR region was determined and was stablished that the RNA structures present in it regulate the translation initiation from the SmRNA. For the 3’UTR region, the RNA secondary structures present were characterized, however, was not possible so assign a single structure to this region, due to its dynamic behavior shown by the results.
Altogether, the results obtained in this thesis work allow us to deepen in the understanding of the regulation of the non-canonical translation initiation process in viral mRNA models.