Tesis Doctorado
Expresión y función del receptor B1 de cininas inducidos por TLR4 en fibroblastos cardiacos
Expression and function of TLR4- induced B1R bradykinin receptor on cardiac fibroblasts
Fecha
2019Autor
Díaz-Araya, Guillermo Antonio
García Nannig, Lorena
UNIVERSIDAD DE CHILE
Institución
Resumen
Los fibroblastos cardiacos (CF) son células claves en la mantención de la matriz extracelular (MEC), homeostasis del tejido cardiaco y también en la reparación tisular a través de la diferenciación a miofibroblasto (MFC). Además, los FC cumplen un rol centinela, siendo capaces de responder a estímulos mecánicos y químicos mediante la liberación de citoquinas y quimioquinas que actúan sobre las células residentes además de las células del sistema inmune.
Los receptores de tipo Toll (TLR) son receptores del sistema inmune, y son capaces de reconocer y activarse frente a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y/o a patrones moleculares asociados a daño (DAMPs). TLR4 es una de las isoformas más estudiadas, ya que su activación es clave en el inicio y la resolución de la respuesta inflamatoria. Los FC son capaces de responder a los DAMPs cuando hay daño en el tejido cardiaco, e incluso, son la mayor fuente de interleuquina-1 (IL-1), que consta de dos isoformas a y b con actividad indistinguible entre una y otra actuando a través de su receptor IL1R1. IL-1a sólo se libera de células dañadas o necróticas reconociendo su rol como DAMPs, gatillando la respuesta inmune innata. Esta citoquina se expresa en FC y en MFC, estando aumentada en el miocardio infartado.
Las cininas han sido descritas como controladores de muchos efectos cardiovasculares, entre ellas, el ser antagonistas al sistema renina-angiotensina- aldosterona (SRAA), produciendo vasodilatación y aumento en la permeabilidad vascular. Adicionalmente, son capaces de reducir la producción de proteínas de la MEC, reduciendo el efecto de un remodelamiento cardiaco adverso. Incluso son claves en el proceso inflamatorio, así como en el daño tisular y en el proceso reparativo. Estos efectos están mediados por la activación de los receptores B1 y B2 de cininas (B1R y B2R). Bajo condiciones fisiológicas, B2R (constitutivo) es el principal responsable de la acción de las cininas. Paralelamente, sólo unos pocos tipos celulares son capaces de expresar B1R (inducible), estando aumentado en condiciones patológicas en las que hay inflamación como en isquemia, enfermedad ateromatosa o exposición a citoquinas proinflamatorias. Se ha descrito la presencia de ambos receptores de cininas en FC de rata y humanos, y en MFC los niveles de B1R se encuentran aumentados en comparación al FC. Estos receptores están acoplados a proteína G (Gai/Gaq), activando diversas cascadas de señalización que llevan a la producción de prostaglandinas (PGs) y óxido nítrico (NO).
No existe evidencia directa que relacione la activación de TLR4 con la expresión de B1R en FC. Nuestros resultados previos demostraron que B1R se encuentra en FC y
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en MFC, mientras que iNOS se encuentra sólo en FC y COX-2 sólo está presente en MFC. También determinamos que PGI2 y NO son liberados por FC y MFC, mostrando un efecto antifibrótico debido a que son capaces de reducir la secreción de colágeno. Sin embargo, aun no se establece si existe una relación entre la activación de TLR4 y/o IL1R1 en la expresión de B1R en FC y MFC. Esto cobra relevancia en daño cardiaco, ya que la inflamación aguda es necesaria para iniciar la cicatrización de la herida.
Con todos estos antecedentes, proponemos la siguiente hipótesis “La activación de TLR4 en fibroblastos cardiacos potencia el efecto antifibrótico de las cininas a través de la inducción del receptor B1R y sus efectores río abajo”.
Para dar respuesta a esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos:
1) Establecer la relación entre la activación de TLR4 y la expresión proteica de B1R en
FC.
2) Determinar si la modificación de los niveles proteicos de B1R en FC se debe a la
secreción de citoquinas producidas por la activación de TLR4.
3) Evaluar si el efecto antifibrótico de las cininas en FC se ve potenciado por el
pretratamiento con LPS.
El modelo experimental se desarrolló con FC obtenidos de ratones WT, IL1R1KO,
humanos y de rata neonata Sprague Dawley, los cuales fueron sometidos a la estimulación con LPS para activar a TLR4 y con IL-1a recombinante para activar IL1R1.
Los resultados de esta tesis indican que IL-1a es un inductor fuerte del ARNm en FC de ratón y humanos, y este incremento es por activación de las vías PI3K/Akt y p38. Adicionalmente la activación de TLR4 por LPS incrementó el ARNm vía PI3K/Akt y p38 además de los niveles proteicos de B1R en FC. TNF-a también aumentó los niveles proteicos de B1R en FC pero de forma más tardía en comparación a LPS. En relación a la vía de las cininas, LPS aumentó los niveles proteicos de COX-2 e iNOS en FC, y también aumentó la secreción de PGI2 y la producción de NO. Además el pretratamiento con LPS potenció el efecto de DAKD sobre la secreción de PGI2 y la producción de NO en FC. Como consecuencia, el pretratamiento con LPS demostró aumentar el efecto antifibrótico de DAKD al reducir aun más los niveles proteicos de Col I que DAKD por si solo.
Con esto podemos plantear que la activación de TLR4 conlleva a una mayor respuesta de las cininas potenciando fundamentalmente su efecto antifibrótico, debido al aumento en la expresión del receptor, como en las proteínas de las vías de señalización activadas por las cininas, lo que se expresa finalmente en una marcada reducción en la sintesis de colágeno. Cardiac fibroblasts (CF) are a key cell for maintaining extracellular matrix (ECM), protein homeostasis in heart tissue and also for cardiac repair through CF-to cardiac myofibroblast (CMF) differentiation. Moreover, CF play a sentinel role in response to mechanical and chemical stimuli by releasing cytokines and chemokines which impact directly on resident cardiac cells and also on infiltrating immune cells.
Toll-like receptors (TLR) recognize and react to highly conserved motifs known as pathogen-associated microbial patterns (PAMPs), or to damage-associated molecular patterns (DAMPs or “alarmins”). TLR4 is one of the most studied isoforms of this family of receptors and its activation is a key element in the initiation and resolution of inflammatory responses. CF are able to respond to DAMPs in the damaged heart. In addition, CF appear to be the main source of the proinflammatory cytokine interleukin-1 (IL-1), which has two distinct gene products a and b with indistinguishable biological activities that mediate their effects through IL-1 receptor 1 (IL1R1) activation. IL-1a is only released from damaged or necrotic cells; however, it has been widely recognized and described as a DAMP that triggers the innate immune response. This cytokine is expressed by cardiac myocytes and CF, with increased levels in infarcted myocardium.
Kinins are described as controllers of many cardiovascular effects and between them as antagonists of the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS), leading to vascular dilation and increased vascular permeability. In addition, kinins decrease ECM protein production leading to reduced adverse myocardial remodeling. Furthermore, kinins play an important role in processes that accompany inflammation, as well as tissue damage and repair. These effects are mediated by the activation of B1 and B2 kinin receptors (B1R and B2R). Under physiological conditions, B2R (constitutive) is the main receptor responsible for the action of kinins. On the other side, only a few cell types express B1R (inducible), and this receptor is increased in pathological conditions that occur with inflammation such as ischemia, atheromatous disease or exposure to inflammatory cytokines.
The presence of both receptors has been described in rat and human CF; however, B1R levels were higher in CMF compared to CF. These receptors are coupled to G proteins (Gai/Gaq), activating different signaling pathways leading to production of prostaglandins and nitric oxide.
Currently, there is no direct evidence available relating TLR4 activation with B1R expression in CF and CMF. Our previous findings demonstrated the presence of B1R in
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CF and CMF, being much higher in CMF; and also, iNOS is present in CF but no in CMF; however, COX-2 is present only in CMF. Also, we determined that PGI2 and NO are released by CF and CMF, which had shown an antifibrotic effect due to their capacity to reduce collagen secretion. However, a relationship between TLR4 or IL1R1 activation and B1R expression in CF and CMF has not yet been established. This could be relevant in cardiac damage where acute cardiac inflammation is necessary to initiate wound healing.
With all these antecedents, we propose the following hypothesis: “TLR4 activation enhances kinins antifibrotic effect through B1R induction and its downstream effectors”
To answer this hypothesis, we propose three main aims:
1) Establish the relationship between TLR4 activation and B1R protein
expression in CF
2) Determine if the modification of B1R protein levels in CF is due to cytokine
secretion produced by TLR4 activation.
3) Evaluate if kinin antifibrotic effect in CF is enhanced by LPS pretreatment.
The experimental model was performed with CF obtained from WT mice, IL1R1KO mice, human and neonatal Sprague Dawley rats, which were submitted to the stimulation with LPS to activate TLR4, and with recombinant IL-1a to activate IL1R1.
The results of this thesis showed that IL-1a is a strong inductor of B1R mRNA in murine and human CF, and this increase is by PI3K/Akt and p38 activation. Moreover, TLR4 activation by LPS increased B1R mRNA through PI3K/Akt and p38 activation, and also B1R protein levels in CF. On the other side, TNF-a was capable to increase B1R protein levels in CF but later than LPS. Related to kinins pathway, LPS increased COX-2 and iNOS protein levels in CF, and also increased PGI2 secretion and NO production. Furthermore, LPS pretreatment potentiated DAKD effect on PGI2 secretion and NO synthesis. As consequence, LPS pretreatment demonstrated to increase DAKD antifibrotic effect by enhancing Col I protein level reduction, rather than DAKD by itself.
Considering all the results obtained in this thesis, we can conclude that TLR4 activation leads to a higher kinins response, enhancing their antifibrotic effect due to the increase in B1R expression and proteins involved in kinin signaling pathways, leading to major reduction of collagen synthesis