Microbiota bacteriana y su relación con genes de resistencia, en provisionales sobre aditamentos PEEK y titanio.

Abstract

El presente estudio tuvo como objetivo determinar la abundancia relativa de los diferentes filos y familias bacterianas en la microbiota presente en la superficie de los pilares temporales implantosoportados de PEEK y titanio, así como la influencia del material del pilar sobre a diversidad bacteriana y la presencia de genes de resistencia a los antibióticos. Se realizó el muestreo a 4 sujetos con implantes en dos etapas: un primer muestreo (Tiempo 0) de placa dental antes de colocar el provisional en la zona edéntula, y un segundo muestreo (Tiempo 1) a los 2 meses de provisionalizado el implante. Se extrajo el ADN desde un total de 24 muestras validas según criterios de inclusión y exclusión, utilizando el kit QIAamp® DNA Microbiome para posteriormente realizar la secuenciación de próxima generación (Next Generation Sequensing, NGS) basado en la amplificación de la región V4 del gen 16S rDNA. Las 24 muestras obtenidas se secuenciaron con los instrumentos de Miseq Illumina a través del protocolo bioinformático de DADA2 para inferir las variantes de secuencias del amplicón (Amplicon Sequence Variant, ASV) en la asignación taxonómica para la caracterización de las comunidades bacterianas. Se utilizaron los índices de Simpson y Shannon para determinar la diversidad alfa utilizando el paquete phyloseq disponible para el software estadístico R. Para el análisis de la diversidad beta se utilizó la medida de Bray-Curtis. El nivel de significancia fue P <0.05. Además, se extrajo el ADN desde un total de 8 muestras válidas según criterios de inclusión y exclusión de igual manera que para 16S rDNA, para proseguir con la secuenciación del genoma completo (Whole Metagenome Sequensing, WMS), para la determinación de los genes de resistencia a los antibióticos presentes en las muestras (Antibiotic Resistance Genes, ARG). Las 8 muestras fueron procesadas a través de la plataforma Illumina HiSeq usando el software TrimGalore para la obtención de las lecturas, las cuales posterior a reportes de calidad, fueron ensambladas usando el software SPAdes específico para el ensamble de genomas bacterianos. Para identificar la presencia de ARG en las muestras, los contigs ensamblados con tamaño mayor a 200 pb fueron anotados utilizando el software ABRicate. Adicionalmente, se identificaron el número de copias del gen 16S rRNA para normalizar el conteo total de ARGs y expresarlo como abundancia relativa. Para el análisis estadístico de abundancia relativa de los ARG totales presentes por muestra, se realizó una prueba de Shapiro-Wilk. Se realizó un ANOVA seguido de un test de TukeyHSD en el software R versión 3.6. P <0,05. Además, se realizó un análisis de identificación de genes de resistencia a metales utilizando el software ABRicate, BLAST y la base de datos BacMet2. En el análisis con NGS, se identificaron un total de 1072 ASV. Al inicio (P0, T0), predominaron los phyla Firmicutes y Proteobacteria. Por otro lado, Veillonella spp., Neisseria spp., Streptococcus spp. y Fusobacterium spp. prevalecieron a nivel de género. Después de la conexión, P1 mostró un aumento en la diversidad bacteriana, mientras que se midió una reducción general para T1. El índice de Shannon confirmó diferencias significativas entre ambos grupos. De acuerdo al WMS, predominó la especie Pseudopropionibacterium propinicum. Los ARG identificados fueron genes altamente prevalentes que confieren resistencia a Macrólidos, Lincosamidas y Streptograminas. El coeficiente de correlación de Spearman reveló que existe correlación ente algunas taxas y los ARG encontrados. La diversidad reducida de la biopelícula observada en los pilares de titanio confirmó una dependencia de las características de la biopelícula del material del pilar temporal, lo que podría ser complejizado por la presencia de genes de resistencia. El establecimiento de una biopelícula desequilibrada y no homogénea puede conducir a una disbiosis, poniendo potencialmente en peligro el sello perimucosal del implante. Por lo que la identificación de genes de resistencia a antibióticos nos permitirá la conformación de terapias antimicrobianas adecuadas, dirigidas en las patologías periimplantarias.