Participación de las especies reactivas del oxígeno y NRF2 en la señalización intracelular inducida por BDNF en neuronas hipocampales

Abstract

El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) es clave para la plasticidad sináptica hipocampal y la memoria espacial. La unión de BDNF a su receptor TrkB activa cascadas de señalización intracelular que involucran la liberación de calcio desde reservorios intracelulares mediada por los receptores de IP3 (IP3R) y los receptores de Ryanodina (RyR). Los RyR cumplen un papel muy importante en la señalización mediada por BDNF, ya que su actividad es esencial para el remodelamiento de las espinas dendríticas e inducción de la expresión de la isoforma RyR2 inducida por BDNF. Recientemente hemos observado que BDNF induce la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), estas podrían promover la actividad de RyR y la activación de factores transcripcionales dependientes de ROS, que modularían los incrementos en el contenido de RyR2 inducido por BDNF. Nrf2 es un factor transcripcional que se activa principalmente por incrementos en las ROS, sin embargo, algunos estudios proponen que es posiblemente la conversación cruzada entre las señales de calcio y las ROS, la que permite la activación de Nrf2. De acuerdo a estos antecedentes, se propuso estudiar si las especies reactivas de oxígeno generadas tras la unión de BDNF a su receptor, inducen la translocación de Nrf2 al núcleo y el incremento en la expresión de RyR2 en cultivo primario de neuronas hipocampales. Los resultados sugieren que la adición de BDNF (50 ng/ml) aumenta la producción de H2O2 citoplasmático, que es dependiente de la entrada de Ca2+ a través de los receptores N-metil D-aspartato (NMDA) y la amplificación de las señales de Ca2+ mediadas por RyR, como también de la actividad de la óxido nítrico sintasa (NOS) y de la NADPH oxidasa 2 (NOX2). La producción de ROS es necesaria para los incrementos en la expresión de RyR2 inducidos por BDNF, ya que es prevenida por el pretratamiento con el antioxidante N-acetilcisteina (NAC) y los inhibidores de la NOX y NOS. Además, la incubación con BDNF induce la translocación al núcleo de Nrf2 luego de 6 horas de exposición y esta translocación depende de la producción de ROS y de la liberación de calcio mediada por RyR. Se evaluó también la participación de proteínas quinasas pertenecientes a la cascada de señalización rio abajo de BDNF, en la translocación de Nrf2 al núcleo. Para ello se bloqueó la activación de las ERK y PI3K, utilizando U0126 y LY294002, respectivamente. De acuerdo a esto, se comprobó la participación de la PI3K, pero no de las ERKs en la translocación de Nrf2 al núcleo inducida por BDNF. Nuestro trabajo propone que la incubación de los cultivos hipocampales con BDNF, genera señales de Ca2+ que dependen de la actividad NMDAR y RyR, que activan las enzimas NOS y NOX2, las cuales inducen incrementos en los niveles citoplasmáticos de ROS. Éstas, por su vez, participan en la señalización inducida por BDNF, modulando la expresión de RyR2 e induciendo la translocación al núcleo de Nrf2. Además, la actividad del RyR modula la generación de ROS y la translocación de Nrf2 al núcleo inducidos por BDNF. En conjunto, nuestros datos sugieren que las ROS, además de las señales de calcio, son importantes en la plasticidad sináptica inducida por BDNF

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is key to hippocampal synaptic plasticity and spatial memory. The binding of BDNF to its TrkB receptor activates intracellular signaling cascades that involve the release of calcium from intracellular reservoirs mediated by the IP3 receptors (IP3R) and Ryanodine receptors (RyR). RyR plays a very important role in BDNF-mediated signaling, since its activity is essential for both the remodeling of dendritic spines and the increases in the expression of RyR2 induced by BDNF. We have recently observed that BDNF induces reactive oxygen species (ROS) generation, which could activate RyR activity and ROS-dependent transcriptional factors, and thus might modulate the increments in the RyR2 content induced by BDNF. Nrf2 is a transcriptional factor that is mainly activated by increases in ROS, however some studies suggest that actually is the cross-talk between the Ca2+ and ROS signals that allow its activation. According to these antecedents, we studied whether the ROS generated in response to the binding of BDNF to its receptor, induce nuclear translocation of Nrf2 and increase RyR2 expression in primary cultures of hippocampal neurons. Our results suggest that the incubation with BDNF (50 ng/ml) increases neuronal cytoplasmic H2O2 production, which is dependent on the entry of Ca2+ through NMDA receptors and the amplification of Ca2 + signals mediated by RyR, as well as of NOS and NOX2 activity. ROS production was also necessary for the increases in RyR2 expression induced by BDNF, as this was prevented by pre-treatment with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) and specific NOX and NOS inhibitors. In addition, the incubation with BDNF induced Nrf2 translocation to the nucleus after 6 horas, and this translocation was dependent of ROS production and of RyR-mediated Ca2+. release. We also evaluated the participation of protein kinases, which might be involved in the translocation of Nrf2 to the nucleus downstream of BDNF signaling. For this, we used the inhibitors U0126 and LY294002 for ERK and PI3K, respectively. In accord, results indicated that ERK`s pathway does not participate, whereas the PI3K pathway does participate in the translocation of Nrf2 to the nucleus induced by BDNF. Our work proposes that the incubation of hippocampal cultures with BDNF generates Ca2 + signals that depend on the NMDAR and RyR activity, which activate the NOS and NOX2 enzymes, which induces increases in the cytoplasmic ROS levels. ROS thus participate in the signaling pathway induced by BDNF, by modulating RyR2 expression and inducing Nrf2 translocation to the nucleus. In addition, we observed that the activity of RyR modulates ROS generation and Nrf2 translocation induced by BDNF. Overall, our data suggest that ROS, in addition to calcium signals, are important in BDNF-induced synaptic plasticity