Caracterización de canales de potasio dependientes de calcio de los cilios de las neuronas olfatorias de rata incorporados en bicapas planas de fosfolípidos

Abstract

En las neuronas receptoras olfatorias los odorantes gatillan respuestas excitatorias e inhibitorias, asociadas a un aumento y una disminución en la frecuencia de los potenciales de acción, respectivamente. En la respuesta inhibitoria participan canales dependientes de nucleótidos cíclicos que mediante una cascada activada por AMP cíclico (AMPc) activan canales de potasio dependientes de calcio (Kca). Estudios llevados a cabo en nuestro laboratorio usando patch clamp demostraron la existencia de canales Kca de conductancia baja, intermedia y alta en los cilios olfatorios (Delgado et al., 2003). En el presente estudio, llevamos a cabo una caracterización biofísica y farmacológica de los canales Kca ciliares. Esto se realizó estudiando los canales Kca provenientes de una fracción purificada de membranas de cilios olfatorios, incorporados en bicapas planas de fosfolípidos. La pureza de la preparación se confirmó por western blot utilizando un anticuerpo contra el canal de sodio dependiente de voltaje, y el análisis de enriquecimiento se llevó a cabo usando anticuerpos contra adenilil ciclasa 111 (ACIII) y el canal de transducción CNG. El tejido olfatorio se extrajo de ratas adultas sacrificadas con una sobredosis de anestesia. Los canales Kca de conductancias baja (S), intermedia (1) y alta (B), fueron incorporados en las bicapas en soluciones simétricas de K+ 100 mM. El canal SKca exhibió una conductancia de 16 pS, insensibilidad al voltaje, una KO.5 por Ca2+ de 40 IJM Y fue bloqueado por apamina. Se identificaron cuatro canales IKca distintos. Uno (IKca-1) presentó dos niveles de conductancia de 30 pS y 50 pS, su KO.5 por Ca2+ fue de 60 ¡.JM, era sensible a clotrimazol e insensible al voltaje y a caribdotoxina (ChTx). Otro canal IKca (IKca-2) mostró una conductancia de 60 pS y era sensible a clotrimazol. Los otros dos canales IKca llamados IKca-3 e IKca-4, presentaron conductancias de 80 y 50 pS, una KO.5 para dependencia de calcio de 36 f.lM para IKca-3 y 43 f.lM para IKca-4, Y sensibilidad a ChTx para I Kca-4. También identificamos un canal BKca con una conductancia de 210 pS, su KO.5 para Ca2+ fue 63 f.lM Y que era sensible a iberiotoxina y ChTx. Los canales SKca, BKca Y uno de los IKca eran muy similares a los registrados mediante patch clamp, en cuanto a su conductancia unitaria, dependencia de calcio y aspecto cinético, sugiriendo que corresponden a los mismos canales Kca. La presencia de los canales SKca (SK3) y BKca en la fracción ciliar se confirmó mediante western blot. La caracterización biofísica y farmacológica de los canales Kca permitirá determinar la contribución de cada uno de ellos a la corriente hiperpolarizante en la respuesta inhibitoria en las neuronas olfatorias.

In olfactory receptor neurons, odorants elicit excitatory and inhibitory responses associated to increases and a decreases in the action potential frequency. In the inhibitory response participate cyclic nucleotide gated channels that via the cyclic AMP cascade activates Ca2+ -dependent K+ (Kca) channels. Patch-clamp studies performed in our laboratory demonstrated the presence of low, intermediate and high conductance Kca channels in the olfactory cilia (Delgado et al., 2003). In the present study, we carried out the biophysical and pharmacological characterization of ciliary Kca channels. This was addressed by studying the Kca channels from a purified rat olfactory cilia membrane fraction, incorporated into planar phospholipid bilayers. The purity of preparation was confirmed by western blotting, using voltage-dependent sodium channel antibody and the enrichment analysis was carried out using antibodies against adenilyl ciclase 111 (ACIII) and the transducción channel CNG. Olfactory tissue was obtained from adult rats sacrificed with an anaesthesia overdose. Low (8), intermediate (1) and high (B) conductance Kca channels, were incorporated into the bilayers, in symmetrical 100 mM K+ solutions. The SKca channel showed a 16 pS conductance, insensitivity to voltage, a KO,5 for Ca2+ of 40 ¡.JM and was blocked by apamin. Four different 1Kca channels were identified. One (IKca-1) presented two conductance levels, of 30 pS and 50 pS, its Ko.5 for Ca2+ was 60 ¡JM, was sensitive to clotrimazole and insensitive to voltage and charybdotoxin (ChTx). Other 1Kca channel (IKca-2) showed an open conductance of 60 p8 and was sensitive to c1otrimazole. Another two IKca channels named 1Kca-3 and IKca-4, presented conductances of 80 and 50 pS and, calcium dependence K05 of 36 ¡JM for IKca-3 and 43 ¡JM for IKca-4, and ChTx sensitivity for IKca-4. We also identified a BKca channel with a 210 conductance, KO,5 for Ca2+ was 63 f,lM and sensitive to iberiotoxin and ChTx. The SKca, the BKca and one of the IKca channels characterized on bilayers, were very similar to the Kca channels, recorded by patch-clamp, regarding their unitary conductance, calcium dependence and kinetic aspect, suggesting that they correspond to the same Kca channels. The presence of the SKca (SK3) and the BKca channels in the ciliary fraction was confirmed by Western blotting. Biophysical and pharmacological characterization of the ciliary Kca channels would allow determine the contribution of each Kca channel to the hiperpolarizing current in the inhibitory response of olfactory neurons.