Exploración de un transportador de NAD+ y/o sus precursores en Leishmania

Abstract

El parásito intracelular Leishmania compite con sus hospederos para la adquisición de compuestos esenciales y, por lo tanto, debe desarrollar mecanismos eficientes de captación. Este proceso es mediado por proteínas transportadoras que desempeñan un papel fundamental en la homeostasis celular, no solo permiten que el parásito compita de manera eficiente con los tejidos, si no también que estos compuestos sean distribuidos de manera competente al interior celular. Múltiples familias de proteínas tienen la capacidad de movilizar moléculas de relevancia metabólica para este tipo organismos, en particular, el trasporte del dinucleótido de nicotinamida y adenina, NAD+ una molécula que desempeña un rol clave en funciones esenciales ha sido descrito principalmente por las proteínas SLC25A, una familia de transportadores mitocondriales (MCF) presente únicamente en eucariotas. En respuesta a la creciente tasa de desarrollo de resistencia a los medicamentos, así como los numerosos efectos secundarios de los mismos para el control de organismos de gran importancia en la salud pública de nuestro país como lo es Leishmania; caracterizar las proteínas responsables de esta translocación, con base en homologías, ya sea de secuencia o estructura con sus ortólogos, promete proporcionar información sobre muchos aspectos básicos de su biología, determinantes para el desarrollo de nuevas terapias en el tratamiento de estas parasitemias. En este trabajo se estudiaron en Leishmania braziliensis, dos candidatos a transportador de NAD+; esto mediante el uso de herramientas bioinformáticas, donde se encontró que las proteínas denominadas LbNDT2 y LbNDT3, poseen todas las características estructurales y de secuencia propias de la familia de transportadores mitocondriales (MCF). Presentando potenciales sitios de modificación postraduccional mediante fosforilación, acetilación y glicosilación. De igual manera, al compararlas con los ortólogos descritos en otros organismos, se evidencia que estas proteínas son altamente conservadas a nivel estructural. Por otro lado, de manera experimental, con el fin de evaluar su capacidad transportadora fueron desarrollados tres acercamientos de manera paralela; el primero involucró el uso del sistema heterólogo algal Chlamydomonas reinhardtii; permitiendo insertar el candidato LbNDT2 en una membrana eucariota; el segundo, mediante la manipulación del vector bacteriano pETx28Mistic, se logró la inserción de las proteínas de interés, en la membrana plasmática de un sistema procariota, realizando una aproximación a su estudio in vivo; y finalmente, ensayos de complementación llevados a cabo en la levadura Saccharomyces cerevisiae, donde fue reestablecido el retraso en el crecimiento de los mutantes, con la inserción de los genes de interés, corroborando de manera indirecta la actividad de las proteínas. Asimismo, utilizando la tecnología del ADN recombinante y el sistema de expresión heterólogo Escherichia coli se obtuvo el antígeno necesario para la producción de una herramienta inmunológica desarrollada en el modelo aviar, que permitió su estudio in situ, encontrando que estas proteínas se ubican a nivel mitocondrial en el estadio de promastigote. En general, corroborar la función de este tipo de proteínas representa un reto; sin embargo, gracias a estos acercamientos se puede concluir que la LbNDT2 y LbNDT3, desempeñan un papel importante para el metabolismo energético en este parásito intracelular. De manera adicional, se estudió mediante la clonación, expresión y purificación, la Triparredoxina peroxidasa citosólica de L. braziliensis (LbTXNPxII) a partir del sistema heterólogo E. coli; permitiendo generar una herramienta inmunológica en modelo aviar, para el estudio in situ de esta proteína y la determinación de posibles interacciones moleculares en el parásito, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación. (Texto tomado de la fuente).

The intracellular parasite Leishmania competes with its hosts for the acquisition of essential compounds and, therefore, must develop efficient uptake mechanisms. This process is mediated by transporter proteins that play a fundamental role in cellular homeostasis, not only allowing the parasite to compete efficiently with the tissues, but also for these compounds to be distributed competently within the cell. Multiple families of proteins can mobilize molecules of metabolic relevance for this type of organisms the transport of the nicotinamide and adenine dinucleotide, NAD+ a molecule that plays a key role in essential functions has been described mainly by the SLC25A proteins, a family of mitochondrial transporters (MCF) present only in eukaryotes. In response to the increasing rate of development of resistance to drugs, as well as the numerous side effects of the same for the control of organisms of great importance in the public health of our country such as Leishmania; characterizing the proteins responsible for this translocation, based on homologies, either in sequence or structure with their orthologs, promises to provide information on many basic aspects of their biology, determining factors for the development of new therapies in the treatment of these parasitemias. In this work, two candidates for the NAD + transporter were studied in Leishmania braziliensis; this using bioinformatic tools, where it was found that the proteins called LbNDT2 and LbNDT3, possess all the structural and sequence characteristics of the family of mitochondrial transporters (MCF). Presenting potential post-translational modification sites by phosphorylation, acetylation, and glycosylation. Similarly, when comparing them with the orthologs described in other organisms, it is evident that these proteins are highly conserved at the structural level. On the other hand, in an experimental way, in order to evaluate its transport capacity, three approaches were developed in parallel; the first involved the use of the heterologous algal system Chlamydomonas reinhardtii; allowing the candidate LbNDT2 to be inserted into a eukaryotic membrane; the second, by manipulating the bacterial vector pETx28Mistic, the proteins of interest were inserted into the plasma membrane of the prokaryotic system, making an approach to their in vivo study; and finally, complementation tests carried out in the yeast Saccharomyces cerevisiae, where the growth retardation of the mutants was reestablished, with the insertion of the genes of interest, indirectly corroborating the activity of the proteins. Likewise, using recombinant DNA technology and the Escherichia coli heterologous expression system, the necessary antigen was obtained to produce an immunological tool developed in the avian model, which allowed the candidates to be studied in situ, finding that these proteins were located at the mitochondrial level in the promastigote stage. In general, corroborating the function of this type of protein represents a challenge; however, thanks to these approaches it can be concluded that LbNDT2 and LbNDT3 play an important role for energy metabolism in this intracellular parasite. Additionally, the cytosolic Triparredoxin peroxidase of L. braziliensis (LbTXNPxII) from the heterologous E. coli system was studied by means of cloning, expression, and purification, allowing the generation of an immunological tool in an avian model, for the in-situ study of this protein and the determination of possible molecular interactions in the parasite, through co-immunoprecipitation assays.