Mecanismos de interacción entre la microcina 24 y su célula bacteriana blanco

Abstract

Las microcinas son un grupo de bacteriocinas de bajo peso molecular (inferior a 10 kDa), producidas principalmente por miembros de la familia Enterobacteriaceae, que inhiben el crecimiento de otras bacterias estrechamente relacionadas con la cepa productora. Estas proteínas son resistentes a condiciones adversas como temperatura y pH extremos, resisten incluso a ciertas proteasas, son solubles en metanol y no son inducibles por el sistema SOS. De todas las microcinas conocidas, la microcina 24 es una de las menos estudiadas. Según la secuencia publicada en GenBank, la microcina 24 se sintetiza como una pre-proteína de 90 aminoácidos que contiene en su extremo amino terminal una señal de exportación, que es cortado en un motivo de doble glicina al ser exportada. La proteína madura (exportada) contiene 74 residuos y posee una masa teórica de 7527 Da. El mecanismo de acción de la microcina 24 no se conoce bien. Carlson y cols. en 2001 publicaron que posiblemente el blanco de acción de esta bacteriocina se encuentra en el citoplasma, sin embargo estudios preliminares de nuestro grupo revelan que el blanco de acción de la microcina 24 es la membrana citoplasmática. En este trabajo se planteó como objetivo caracterizar la expresión de la microcina 24 e identificar el mecanismo de acción por el cual genera la muerte bacteriana.

Para caracterizar la expresión de la microcina 24 se analizó el sobrenadante de un cultivo de E. coli MC1061pGOB18, en diferentes etapas de crecimiento, en búsqueda de actividad antimicrobiana. Se determinó que la microcina 24 comienza a producirse en fase exponencial de crecimiento. Un análisis transcripcional mediante RT-PCR permitió observar que la microcina 24 se transcribe junto con su inmunidad en una sola unidad bicistrónica, lo que le permite a la cepa productora regular la expresión de la microcina 24, de manera tal que no resulte tóxica para sí misma. La purificación de esta microcina se realizó a partir del sobrenadante de un cultivo productor de microcina 24, en un sistema de cromatografía hidrofóbica en fase inversa utilizando como matriz sólida una columna de Sed-Pack C18 y diferentes concentraciones de metanol como eluyente. Las diferentes fracciones obtenidas fueron evaluadas en búsqueda de actividad antimicrobiana mediante ensayos de actividad en placa. La microcina presente en las fracciones que exhibieron actividad fueron re-purificadas mediante HPLC con columna Sed-Pack C8 como matriz sólida y acetonitrilo 40% como eluyente. Esta microcina purificada se sometió a un análisis mediante espectrometría de masa, encontrándose que la microcina 24 posee una masa experimental de 7274 Da, presentando una diferencia de 253 Da menos que la masa teórica deducida. Esta diferencia se debe a un error en la secuencia publicada en Genbank, la que fue detectada al secuenciar el sistema productor completo. La corrección de la secuencia permite deducir una masa teórica de 7293 Da, que se asemeja más al valor experimental. No sólo en la secuencia de la microcina se descubrió errores, también se observó una discrepancia en el gen mdbA que originalmente contenía un dominio incompleto de unión a DNA, pero luego de la corrección se observó que la proteína codificada contiene el dominio completo. Este dominio es común en proteínas de la familia H-NS que se unen a secuencias ricas en timinas y adeninas silenciando genes. En función a estas diferencias, los genes del sistema fueron renombrados como sigue: mcnR (antiguamente llamado mdbA), mcnI (mtfI), mcnN (mtfS), mcnA (mtfA) y mcnB (mtfB).

Para determinar el mecanismo de acción de la microcina 24 se propuso como hipótesis que esta microcina genera poros en la membrana (en función a la alta identidad con la microcina E492, una microcina formadora de poros), ergo, siendo su mecanismo bactericida. Para demostrar esto se realizaron ensayos de actividad β galactosidasa en E. coli DH5a y E. coli HB101, recuento de células viables y microscopía de fluorescencia. En todos estos experimentos se concluyó que la microcina 24 permeabiliza la membrana interna de las bacterias sensibles. Considerando que todas las microcinas conocidas utilizan el sistema de transporte de hierro para ingresar a la bacteria, y que las mutantes carentes de los receptores Fep, Fiu y Cir siguen siendo sensibles a la microcina 24, se propuso que el receptor de la microcina 24 es FhuA. Analizando la sensibilidad de las cepas de E. coli C600, JM110 y P8, se demostró experimentalmente que el receptor para esta microcina es efectivamente la proteína FhuA (receptor del ferricromo hidroxamato). FhuA pertenece a un sistema de 4 miembros (FhuA, FhuC, FhuD, FhuB) encargados de la internalización del hierro, por medio del sideróforo ferricromo hidroxamato. Generando una mutante en los genes fhuCDB por el método de Wanner, se determinó que estos elementos participan en el mecanismo de acción y empleando mutantes individuales para fhuCDB se determinó que la microcina 24, al ingresar al periplasma por medio de FhuA, emplea las proteínas FhuD y FhuB para permeabilizar la membrana interna