Producción de la lipasa lip2 de candida rugosa en el sistema pichia pastoris: caracterización y aplicación en reacciónes de síntesis

Abstract

Una de las aplicaciones más comunes de la Biotecnología es la producción y utilización de enzimas. Entre éstas se encuentran las lipasas, una enzima con numerosas aplicaciones en biocatálisis debido tanto a la explotación de su reacción natural, hidrólisis de enlaces éster, como su utilización en reacciones de transesterificación y síntesis orgánica. Por este motivo, las lipasas son unas enzimas muy utilizadas en un gran número de aplicaciones de muy diverso índole industrial. Actualmente, la mayoría de las lipasas comerciales se obtienen vía fermentativa a partir de una amplia variedad de microorganismos entre los que destaca la levadura Candida rugosa. Existen lipasas comerciales de este microorganismo pero tienen el inconveniente de ser una mezcla de isoenzimas. Se han identificado hasta 7 genes potencialmente codificadores de isoenzimas en Candida rugosa, identificándose como mínimo tres isoenzimas diferentes y en diferentes proporciones en preparados comerciales, las denominadas Lip 1, Lip2 y Lip3. Esta heterogeneidad en los preparados comerciales comporta que en reacciones de síntesis química para la resolución de mezclas racémicas se obtengan variaciones importantes de enantioselectividad dependiendo del lote de origen de la enzima. Por consiguiente, es obvio que la manera de solucionar este problema es trabajar con un preparado de la isoenzima pura. Debido a la gran homología existente entre las diferentes isoenzimas, los procesos de purificación para obtenerlas puras conllevan unos rendimientos muy bajos, inferiores al 10%, lo que hace el proceso inviable desde el punto de vista de su aplicación industrial. La alternativa consiste en producir la isoenzima pura expresada heterólogamente en otro microorganismo. No obstante, esta vía topa también con la peculiaridad de que Candida no posee un código genético universal para el amino ácido serina, con lo que al expresar la lipasa por las técnicas clásicas de ADN recombinante en microorganismos huéspedes, se obtiene la isoenzima no activa debido al cambio de aminoácidos serina en su secuencia. La solución pasa por la substitución de éstos aminoácidos concretos mediante mutagénesis dirigida o la construcción del gen sintético completo, adaptado al mismo tiempo el uso de codones de todo el gen al nuevo huésped. En el grupo de Ingeniería de Bioprocesos y Biocatálisis Aplicada del Departamento de Ingeniería Química de la UAB se lleva años trabajando en la producción y aplicación en Biocatálisis de lipasas nativas de Candida rugosa. Más recientemente se ha comenzado a estudiar las prestaciones de la levadura metilotrófica Pichia pastoris como sistema de expresión de productos heterólogos. Por consiguiente, el grupo de investigación donde se ha realizado la presente tesis doctoral estaba en disposición de estudiar la producción heteróloga de una isoenzima de C. rugosa en el microorganismo huésped Pichia pastoris. En concreto se planteó la producción heteróloga de Lip2 puesto que es una isoenzima prácticamente inexistente en los preparados comerciales, Para ello, con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia nucleotídica de rLip2 para su óptima expresión en Pichia pastoris, su inserción en el vector de expresión pPICZa bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol oxidasa (AOXI), su transformación en Pichia y la selección de clones productores de rLip2 activa hasta niveles de producción en Erlenmeyers. Una vez comprobada la obtención de clones productores de rLip2 funcional, el siguiente pasó fue caracterizar su producción en bioreactor. Primeramente se determinó el pH óptimo mediante estrategias de operación en discontinuo como paso previo a la optimización del bioprocesos trabajando en una estrategia de operación en discontinuo alimentado (jed-batch) en cultivos de elevadas densidades celulares. Para conseguir un bioproceso lo más reproducible posible se utilizó todo el equipo de monitorización y control de bioprocesos desan-ollado en otras tesis doctorales dentro del mismo grupo. Los primeros resultados fueron decepcionantes ya que, a diferencia de la operación en discontinuo, al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó presencia de actividad lipásica. Los geles de electroforesis revelaron la presencia de proteínas de mayor peso molecular del correspondiente a rLip2, pesos moleculares múltiplos de la misma. Análisis por Western revelaron que se trataba de agregados de rLip2, sugiriendo que las formas agregadas del enzima producido no tenían actividad lipásica. Una posible hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de rLip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo (alta fuerza iónica). Con el objetivo de recuperar la actividad enzimática, se diseñó un proceso de purificación consistente en la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración. Aplicando este proceso, se consiguió detectar el monómero de rLip2 y asociado a ello la presencia de actividad lipásica. Comparándose con los valores de actividad obtenidos en la producción con el microorganismo natural, la producción del producto heterólogo fue 1 O veces superior, con el inconveniente de no poder detectar y cuantificar el producto hasta el final del proceso de diafiltración. A continuación se realizó una caracterización bioquímica preliminar y una caracterización funcional determinándose el óptimo de temperatura y pH, su especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos y su comparación con la Lip2 nativa, con lipasas comerciales que tienen una mezcla de isoenzimas y otras isoenzimas recombinantes de Candida. Interesante desde el punto de vista de su aplicación industrial fue el estudio de estabilidad de la rLip2 frente a pH y temperatura, para lo que se realizó un diseño de experimentos. El estudio demostró que la enzima recombinante en solución era mucho menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rLip2 se consiguió obtener una isoenzima mucho más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada. Finalmente se realizó un estudio preliminar de aplicación biocatálitica de esta isoenzima recombinante en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas rácemicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, un intermediario quiral de la industria farmacéutica la rLip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno, un antiinflamatorio no esteroidal, se obtuvieron mejores resultados en términos de conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa.