| dc.description.abstract | Una de las aplicaciones más comunes de la Biotecnología es la producción y utilización
de enzimas. Entre éstas se encuentran las lipasas, una enzima con numerosas
aplicaciones en biocatálisis debido tanto a la explotación de su reacción natural,
hidrólisis de enlaces éster, como su utilización en reacciones de transesterificación y
síntesis orgánica. Por este motivo, las lipasas son unas enzimas muy utilizadas en un
gran número de aplicaciones de muy diverso índole industrial.
Actualmente, la mayoría de las lipasas comerciales se obtienen vía fermentativa a partir
de una amplia variedad de microorganismos entre los que destaca la levadura Candida
rugosa.
Existen lipasas comerciales de este microorganismo pero tienen el inconveniente de ser
una mezcla de isoenzimas. Se han identificado hasta 7 genes potencialmente
codificadores de isoenzimas en Candida rugosa, identificándose como mínimo tres
isoenzimas diferentes y en diferentes proporciones en preparados comerciales, las
denominadas Lip 1, Lip2 y Lip3. Esta heterogeneidad en los preparados comerciales
comporta que en reacciones de síntesis química para la resolución de mezclas racémicas
se obtengan variaciones importantes de enantioselectividad dependiendo del lote de
origen de la enzima.
Por consiguiente, es obvio que la manera de solucionar este problema es trabajar con un
preparado de la isoenzima pura. Debido a la gran homología existente entre las
diferentes isoenzimas, los procesos de purificación para obtenerlas puras conllevan unos
rendimientos muy bajos, inferiores al 10%, lo que hace el proceso inviable desde el
punto de vista de su aplicación industrial.
La alternativa consiste en producir la isoenzima pura expresada heterólogamente en
otro microorganismo. No obstante, esta vía topa también con la peculiaridad de que
Candida no posee un código genético universal para el amino ácido serina, con lo que al
expresar la lipasa por las técnicas clásicas de ADN recombinante en microorganismos
huéspedes, se obtiene la isoenzima no activa debido al cambio de aminoácidos serina en
su secuencia. La solución pasa por la substitución de éstos aminoácidos concretos
mediante mutagénesis dirigida o la construcción del gen sintético completo, adaptado al
mismo tiempo el uso de codones de todo el gen al nuevo huésped.
En el grupo de Ingeniería de Bioprocesos y Biocatálisis Aplicada del Departamento de
Ingeniería Química de la UAB se lleva años trabajando en la producción y aplicación en
Biocatálisis de lipasas nativas de Candida rugosa. Más recientemente se ha comenzado
a estudiar las prestaciones de la levadura metilotrófica Pichia pastoris como sistema de expresión de productos heterólogos. Por consiguiente, el grupo de investigación donde
se ha realizado la presente tesis doctoral estaba en disposición de estudiar la producción
heteróloga de una isoenzima de C. rugosa en el microorganismo huésped Pichia
pastoris. En concreto se planteó la producción heteróloga de Lip2 puesto que es una
isoenzima prácticamente inexistente en los preparados comerciales,
Para ello, con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia
nucleotídica de rLip2 para su óptima expresión en Pichia pastoris, su inserción en el
vector de expresión pPICZa bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol
oxidasa (AOXI), su transformación en Pichia y la selección de clones productores de
rLip2 activa hasta niveles de producción en Erlenmeyers.
Una vez comprobada la obtención de clones productores de rLip2 funcional, el siguiente
pasó fue caracterizar su producción en bioreactor. Primeramente se determinó el pH
óptimo mediante estrategias de operación en discontinuo como paso previo a la
optimización del bioprocesos trabajando en una estrategia de operación en discontinuo
alimentado (jed-batch) en cultivos de elevadas densidades celulares.
Para conseguir un bioproceso lo más reproducible posible se utilizó todo el equipo de
monitorización y control de bioprocesos desan-ollado en otras tesis doctorales dentro del
mismo grupo.
Los primeros resultados fueron decepcionantes ya que, a diferencia de la operación en
discontinuo, al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó
presencia de actividad lipásica. Los geles de electroforesis revelaron la presencia de
proteínas de mayor peso molecular del correspondiente a rLip2, pesos moleculares
múltiplos de la misma. Análisis por Western revelaron que se trataba de agregados de
rLip2, sugiriendo que las formas agregadas del enzima producido no tenían actividad
lipásica.
Una posible hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de
rLip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo (alta fuerza iónica). Con el objetivo
de recuperar la actividad enzimática, se diseñó un proceso de purificación consistente en
la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración. Aplicando
este proceso, se consiguió detectar el monómero de rLip2 y asociado a ello la presencia
de actividad lipásica. Comparándose con los valores de actividad obtenidos en la
producción con el microorganismo natural, la producción del producto heterólogo fue
1 O veces superior, con el inconveniente de no poder detectar y cuantificar el producto
hasta el final del proceso de diafiltración. A continuación se realizó una caracterización bioquímica preliminar y una
caracterización funcional determinándose el óptimo de temperatura y pH, su
especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos y su comparación con la Lip2 nativa,
con lipasas comerciales que tienen una mezcla de isoenzimas y otras isoenzimas
recombinantes de Candida.
Interesante desde el punto de vista de su aplicación industrial fue el estudio de
estabilidad de la rLip2 frente a pH y temperatura, para lo que se realizó un diseño de
experimentos. El estudio demostró que la enzima recombinante en solución era mucho
menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rLip2 se consiguió obtener
una isoenzima mucho más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada.
Finalmente se realizó un estudio preliminar de aplicación biocatálitica de esta isoenzima
recombinante en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas
rácemicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica
del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, un intermediario quiral de la industria farmacéutica la
rLip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno,
un antiinflamatorio no esteroidal, se obtuvieron mejores resultados en términos de
conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa. | |
