Estructura y función de los dominios de transactivación del factor de transcrición runx2.

Abstract

En la etapa de maduración de la diferenciación osteoblástica se expresa el factor de transcripción Runx2, el cual regula la transcripción de componentes de la matriz ósea, marcando el inicio de la mineralización de la matriz extracelular. Runx2 es esencial para la diferenciación osteoblástica, ya que animales knock-out carecen de tejido óseo, resultando en un fenotipo letal. Por otra parte, deleciones o mutaciones en el gen que lo codifica, producen la enfermedad humana displasia cleidocraneal. Runx2 es una proteína modular. Se han descrito muchos dominios que en su mayoría son suficientes para llevar a cabo sus respectivas funciones. Esta tesis se ha avocado al estudio de los dominios de transactivación de Runx2, con los cuales este factor de transcripción recluta actividades remodeladoras de cromatina directa o indirectamente, permitiéndole modificar la estructura de los promotores de sus genes blanco para aumentar la actividad transcripcional y así generar el fenotipo óseo. En particular, se trabajó con el dominio de transactivación TM, que comprende a los residuos 347-430 y que está encargado de la transactivación basa¡ de genes tejido óseo-específicos. Además, se estudió el dominio 230-361, responsable de la transactivación mediada por 1a,25-dihidroxivitamina D 3 . Aunque para ambos dominios se dispone de datos funcionales, aún no existe información estructural que permita comprender a cabalidad su participación en el proceso de diferenciación osteoblástica. El dominio de transactivación T1T2 reside en el mismo segmento de la estructura primaria que el determinado para el dominio de localización a la matriz nuclear (NMTS). Por lo cual, las conclusiones que provienen de experimentos clásicos utilizando deleciones y midiendo actividad transcripcional o localización subnuclear no explican la función específica de estos dominios. Por lo tanto, la estructura tridimensional permitiría acotar los dominios funcionales y así diferenciar ambas actividades. El dominio 230-361 ha sido recientemente establecido en el laboratorio como dominio de transactivación. Estudios utilizando deleciones sugieren que el dominio 230- 361 es suficiente para interaccionar con múltiples proteínas involucradas en la diferenciación osteoblástica, tales como VDR, C/EBP y p300. En este caso, estamos interesados en las interacciones proteína-proteína que modulan la transactivación génica mediada por la,25-dihidroxivitamina D 3 y cómo éstas están reguladas. En esta tesis se intentó purificar y cristalizar estos dominios para resolver su estructura terciaria. Por otra parte, se analizó la interacción in vitro entre el dominio 230- 361 y VDR y CIEBP mediante GST-pull down". Además, se estudió la modulación de dichas interacciones por fosforilación por proteína quinasa C. El dominio T1T2 resultó ser sumamente inestable y su purificación para estudios estructurales fue infructuosa en sistemas de expresión procarionte y eucarionte, indicando que este dominio debe estar en un contexto celular para mantener su conformación activa. El dominio 230-361 fusionado a GST fue purificado y cristalizado. Los cristales difractaron hasta 2.7A. La estadística de los datos determinó 3.3A como el límite de resolución. Se realizó la reducción e indexación de los datos con los cuales se resolverá la estructura terciaria, lo que permitirá aumentar nuestro entendimiento del mecanismo de transactivación dependiente de 1a,25-dihidroxivitamina D 3 mediado por Runx2. Por otra parte, se determinó que el dominio 230-361 es suficiente y necesario para interaccionar con el receptor de la,25-dihidroxivitamina D3 . Sin embargo, no es suficiente para la interacción con C/EBP. La fosforilación por PKC no influye en la interacción entre Runx2 y CIEBPÍI3, mientras que inhibe la interacción con VDR, pudiendo ser uno de los mecanismos que permite que la interacción sea excluyente y que regule la transactivación estimulada por la,25-dihidroxivitamina D3.