| dc.description.abstract | En la etapa de maduración de la diferenciación osteoblástica se expresa el factor de
transcripción Runx2, el cual regula la transcripción de componentes de la matriz ósea,
marcando el inicio de la mineralización de la matriz extracelular. Runx2 es esencial para
la diferenciación osteoblástica, ya que animales knock-out carecen de tejido óseo,
resultando en un fenotipo letal. Por otra parte, deleciones o mutaciones en el gen que lo
codifica, producen la enfermedad humana displasia cleidocraneal.
Runx2 es una proteína modular. Se han descrito muchos dominios que en su
mayoría son suficientes para llevar a cabo sus respectivas funciones. Esta tesis se ha
avocado al estudio de los dominios de transactivación de Runx2, con los cuales este
factor de transcripción recluta actividades remodeladoras de cromatina directa o
indirectamente, permitiéndole modificar la estructura de los promotores de sus genes
blanco para aumentar la actividad transcripcional y así generar el fenotipo óseo.
En particular, se trabajó con el dominio de transactivación TM, que comprende a
los residuos 347-430 y que está encargado de la transactivación basa¡ de genes tejido
óseo-específicos. Además, se estudió el dominio 230-361, responsable de la
transactivación mediada por 1a,25-dihidroxivitamina D 3 . Aunque para ambos dominios se
dispone de datos funcionales, aún no existe información estructural que permita
comprender a cabalidad su participación en el proceso de diferenciación osteoblástica.
El dominio de transactivación T1T2 reside en el mismo segmento de la estructura
primaria que el determinado para el dominio de localización a la matriz nuclear (NMTS).
Por lo cual, las conclusiones que provienen de experimentos clásicos utilizando
deleciones y midiendo actividad transcripcional o localización subnuclear no explican la
función específica de estos dominios. Por lo tanto, la estructura tridimensional permitiría
acotar los dominios funcionales y así diferenciar ambas actividades.
El dominio 230-361 ha sido recientemente establecido en el laboratorio como
dominio de transactivación. Estudios utilizando deleciones sugieren que el dominio 230-
361 es suficiente para interaccionar con múltiples proteínas involucradas en la
diferenciación osteoblástica, tales como VDR, C/EBP y p300. En este caso, estamos
interesados en las interacciones proteína-proteína que modulan la transactivación génica
mediada por la,25-dihidroxivitamina D 3 y cómo éstas están reguladas.
En esta tesis se intentó purificar y cristalizar estos dominios para resolver su
estructura terciaria. Por otra parte, se analizó la interacción in vitro entre el dominio 230-
361 y VDR y CIEBP mediante GST-pull down". Además, se estudió la modulación de
dichas interacciones por fosforilación por proteína quinasa C.
El dominio T1T2 resultó ser sumamente inestable y su purificación para estudios
estructurales fue infructuosa en sistemas de expresión procarionte y eucarionte,
indicando que este dominio debe estar en un contexto celular para mantener su
conformación activa.
El dominio 230-361 fusionado a GST fue purificado y cristalizado. Los cristales
difractaron hasta 2.7A. La estadística de los datos determinó 3.3A como el límite de
resolución. Se realizó la reducción e indexación de los datos con los cuales se resolverá
la estructura terciaria, lo que permitirá aumentar nuestro entendimiento del mecanismo de
transactivación dependiente de 1a,25-dihidroxivitamina D 3 mediado por Runx2.
Por otra parte, se determinó que el dominio 230-361 es suficiente y necesario para
interaccionar con el receptor de la,25-dihidroxivitamina D3 . Sin embargo, no es suficiente
para la interacción con C/EBP. La fosforilación por PKC no influye en la interacción entre
Runx2 y CIEBPÍI3, mientras que inhibe la interacción con VDR, pudiendo ser uno de los
mecanismos que permite que la interacción sea excluyente y que regule la
transactivación estimulada por la,25-dihidroxivitamina D3. | |
