Detección de especies de Leishmania (Viannia) empleando la plataforma CRISPR/Cas12a

Abstract

La leishmaniosis es una enfermedad desatendida causada por parásitos protozoos del género Leishmania y transmitida por insectos vectores del género Lutzomyia en el Nuevo Mundo. Las infecciones por Leishmania braziliensis son predominantes en América Latina y pueden generar lesiones cutáneas y mucosas. El diagnóstico temprano y preciso de leishmaniosis es necesario para un tratamiento eficaz. Las principales pruebas moleculares utilizadas en el diagnóstico tienen una alta sensibilidad y especificidad; sin embargo, entre sus desventajas se encuentran su alto costo, tiempo de procesamiento y se requiere de centros especializados para su ejecución (Akhoundi et al., 2017). En la última década se han propuesto nuevas tecnologías de diagnóstico molecular que se dirigen a ensayos con potencial aplicación en el punto de atención del paciente. Destaca la plataforma basada en los sistemas CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas)-Cas, que es un método molecular novedoso aplicado a la detección de agentes patógenos. Chen y colaboradores demostraron su aplicación en la detección del virus del papiloma humano en muestras clínicas. La prueba consiste en un paso de amplificación isotérmica con recombinasa y polimerasa seguido del reconocimiento de la secuencia diana por un complejo ribonucleico conformado por un ARN guía y la endonucleasa Cas12a. Este complejo produce un corte específico de la secuencia de ADN diana, proceso que desencadena la actividad colateral indiscriminada de la enzima Cas12a. Esto permite escindir una sonda reportera que emite una señal fluorescente medible (Chen et al., 2018). Los reportes que aplican este método se han incrementado durante la pandemia de COVID-19, ya que se utilizó esta tecnología en la detección del agente causal, el virus SARS-CoV-2 (Broughton et al., 2020). El presente trabajo tuvo como objetivo optimizar y evaluar el sistema CRISPR-Cas12a como potencial método de detección molecular del subgénero Viannia de Leishmania que incluye las especies patógenas para el ser humano predominantes en América Latina. Para tal fin, se seleccionó como diana multicopia al ADN de minicírculos del kinetoplasto (ADNk), en particular una región conservada en especies de Leishmania (Viannia). Se optimizó el ensayo considerando un paso de amplificación por PCR convencional seguido de la detección con CRISPR-Cas12a. Para la evaluación de la sensibilidad analítica se utilizó ADN genómico extraído de la cepa de referencia de L. braziliensis MHOM/BR/75/M2904 para construir una curva de equivalentes genómicos de parásitos (e.g.p) (Jara et al., 2013). La evaluación de la especificidad analítica incluyó cepas de referencia de los subgéneros Viannia y Leishmania. El ensayo PCR/CRISPR-Cas12a logró detectar 5x10-2 e.g.p, similar a lo obtenido por PCR en tiempo real (prueba de referencia). Además, nuestra herramienta basada en Cas12a permitió la detección específica del subgénero Viannia de Leishmania y no mostró reacción cruzada con ADN humano o de la cepa Y de Trypanosoma cruzi. Hemos iniciado la evaluación del desempeño del método PCR/CRISPR en muestras clínicas en comparación con la PCR en tiempo real. Los resultados preliminares apoyan la aplicabilidad de la detección basada en CRISPR para fines de diagnóstico de primera línea de infección por Leishmania a nivel del subgénero Viannia.