Sistema de expresión heteróloga del componente nlmA de la mutacina IV de Streptococcus mutans UA159, en la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3)

Abstract

Streptococcus mutans es una bacteria Gram positivo que se encuentra en la cavidad oral, siendo uno de los principales patógenos asociados a la cariogénesis. Posee variadas cualidades que le permiten establecerse en la cavidad oral, entre ellas encontramos su gran capacidad de adhesión, formación de biopelícula y síntesis de bacteriocinas, siendo esta última la más atractiva desde el punto de vista biotecnológico. Estas bacteriocinas producidas por S. mutans son denominadas mutacinas y han sido clasificadas según su composición aminoacídica en mutacinas lantibióticas y no-lantibióticas. Entre las mutacinas no lantibióticas, encontramos a la mutacina IV, codificada por el operón nlm, la cual posee 2 genes estructurales denominados nlmA y nlmB. El objetivo de esta tesis es crear un sistema de expresión heteróloga con el fin de producir y caracterizar el producto del componente nlmA de la mutacina IV. Empleando el vector RSF-duet, el cual posee 2 sitios de múltiple clonamiento, hemos clonado de forma independiente, los genes del sistema transportador de la microcina V en el MCS 2 y uno de los genes del sistema mutacina IV (componente nlmA antecedido por la secuencia que codifica para el péptido señal de la microcina V), en el MCS 1. De esta manera utilizando la cepa E. coli BL21 (DE3), hemos logrado sintetizar y exportar hacia el medio extracelular el producto del componente nlmA (NlmA). Se determinó que la óptima producción de NlmA recombinante, se obtiene empleado una concentración de 1 mM del inductor IPTG, alcanzando una concentración de 63,7μg/mL de proteína, luego de ser purificada desde el medio de cultivo. NlmA recombinante presentó termostabilidad en un amplio rango de temperaturas (-80 a 100°C) y su actividad no se vió afectada frente a variados solventes ya sean estos orgánicos o inorgánicos. Por otra parte, NlmA recombinante, posee actividad frente a S. salivarius, S. gordonii, S. sanguinis y bacterias Gram positivo de interés clínico como Listeria monocitogenes, Staphylococcus aureus y Enterococcus spp., sin embargo, no prensentó actividad sobre aislados clínicos de S. mutans Estos resultados contribuyen con el diseño de una nueva herramienta para la producción y estudio de polipéptidos pequeños tipo bacteriocina y, por otra parte, permitió la caracterización del producto codificado por el componente nlmA de la mutacina IV.

Streptococcus mutans is a Gram positive bacteria found in the oral cavity, pathogens associated with cariogenesis. It has varied qualities that allow it to settle down in the oral cavity, within them find their adhesion, biofilm formation and synthesis of bacteriocins, the latter being the most attractive from the point of biotechnologically. These bacteriocins produced by S. mutans are termed mutacins and are divide into two groups: lantibiotics mutacins and non-lantibiotic mutacins. Mutacin IV is a dipeptide non-lantibiotic mutacin encoded by operon nlm and being nlmA and nlmB the structural genes. The aims of study is develop a polypeptide production heterologous system for produce and characterize the nlmA component of mutacin IV. Using the RSF-duet vector, wich has two multiple cloning site, we cloned independently transporter microcin V in MCS 2 and recombinant mutacin (nlmA component preceded by the signal microcin V peptide), in MCS 1. Thereby using the strain E. coli strain BL21 (DE3), we have successfully synthesized and export into the extracellular medium the nlmA component. We found that optimal production of NlmA recombinant, employee 1 mM IPTG inducer, reaching a concentration of 63,7μg / mL of protein, after being purified from the culture medium. Subsequently characterization showed thermostability in a wide temperature range (-80 to 100°C), retains its activity against various solvents whether they are organic and inorganic. Regarding, the inhibitory activity of NlmA recombinant component exhibit activity against S. salivarius, S. gordonii, S. sanguinis and other clinical interest Gram positive bacterias as Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. However is unsuccessful against clinical isolates of S. mutans These results contribute a new tool for production and study of small peptides like bacteriocin and on the other hand have en elucidated new features nlmA component mutacin IV.