Rol de la proteína chaperona Hfq en el mantenimiento de la homeostasis de la envoltura bajo estrés osmótico en el patógeno de salmónidos Yersinia ruckeri

Abstract

Yersinia ruckeri es una bacteria Gram negativo capaz de transitar entre agua dulce y salada. Es un patógeno de salmones que genera brotes de infección en las salmoneras, afectando la producción de salmones a nivel mundial. En el contexto de la exposición a condiciones hiperosmóticas, es sabido que otras bacterias activan sistemas transcripcionales de respuesta a estrés de envoltura, como los sistemas RpoE y CpxAR. A su vez, estos sistemas mantienen la homeostasis de la envoltura bacteriana mediante la síntesis de RNAs pequeños no codificantes (sRNA) que se asocian a la proteína chaperona Hfq y a un mRNA blanco, reprimiendo o promoviendo su expresión para modular la arquitectura del lipopolisacárido (LPS) y de la envoltura celular en conjunto (membrana interna (MI), membrana externa (ME), peptidoglicano (PG)). A la fecha, se desconocen los mecanismos moleculares de respuesta al estrés salino en Y. ruckeri. Por tal razón, en esta Tesis nos propusimos estudiar el rol de Hfq en la respuesta a estrés de envoltura bajo estrés osmótico en Y. ruckeri. Para esto, se utilizó una cepa deficiente del gen hfq (Δhfq) de Y. ruckeri que fue tratada con distintas concentraciones de NaCl para generar la condición de estrés osmótico y realizar análisis fenotípicos como curvas de crecimiento, ensayos de UFC, perfil de proteínas de membrana externa y LPS y microscopías electrónicas (TEM). Por otro lado, se realizaron análisis para evaluar si el estrés generado por el tratamiento con NaCl genera daño en la membrana, lo cual fue evaluado por análisis de citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, demostrándose que la cepa Δhfq presenta un fenotipo más resistente a altas concentraciones de NaCl, en comparación con la cepa silvestre (WT). Además, se analizó diferencias en los perfiles de proteínas de membrana externa y la composición del LPS, mediante SDS-PAGE, evidenciándose una desregulación respecto al perfil de la cepa WT. Finalmente, se analizó la expresión génica de reguladores mediante RT-qPCR y se observó que la condición de NaCl usada genera estrés por envoltura, aumentando la expresión de genes como rpoE, cpxR, degP y de sRNAs como MicA y CpxQ. Por otro lado, en la cepa Δhfq los niveles de los sRNAs MicA y CpxQ disminuyen significativamente respecto a lo observado en la cepa WT tratada con NaCl. Asimismo, en la cepa Δhfq se observa una desregulación en la expresión de los genes relacionados con la homeostasis de la envoltura bacteriana; ompA/F/C, skp, lpp, rpoE y cpx. En su conjunto, estos resultados indican que la cepa Δhfq presenta diversos fenotipos alterados relacionados con la homeostasis de envoltura, así como también con la resistencia al estrés osmótico, sugiriendo un rol regulatorio de Hfq en la respuesta global a estrés por envoltura gatillado por NaCl.

Yersinia ruckeri is a Gram-negative bacterium capable of transiting between fresh and saltwater. It is a salmon pathogen that generates outbreaks in salmon farms affecting salmon production worldwide. In the context of exposure to hyperosmotic conditions, other bacteria are known to activate envelope stress response of transcriptional systems such as RpoE and the CpxAR. In turn, these systems maintain bacterial envelope homeostasis by synthesizing small non- coding RNAs (sRNAs) that associate with the chaperone protein Hfq and a target mRNA, repressing or promoting their expression to modulate the architecture of the lipopolysaccharide (LPS) and the cell envelope (inner membrane (IM), outer membrane (OM), and peptidoglycan (PG)). To date, the molecular mechanisms of osmotic stress response in Y. ruckeri are unknown. For this reason, in this Thesis we aim to study the role of Hfq in the response to envelope stress under osmotic stress in Y. ruckeri. For this, we used a strain deficient in the hfq gene (Δhfq) that was treated with different concentrations of NaCl to generate the osmotic stress condition and we performed phenotypic analyses such as growth curves, CFU assays, outer membrane protein and LPS profiles, and electron microscopy (TEM) analysis. On the other hand, analyses were performed to assess whether the stress generated by NaCl treatment generates membrane damage. Flow cytometry analysis and transmission electron microscopy demonstrated that the Δhfq strain exhibits a phenotype more resistant to high concentrations of NaCl, compared to the wild-type strain (WT). In addition, differences in outer membrane protein profiles and LPS composition were analyzed by SDS-PAGE and deregulation was evidenced with respect to the WT strain. Finally, gene expression of regulators was analyzed by RT-qPCR, and it was observed that the NaCl condition used generates envelope stress, increasing the expression of genes such as rpoE, cpxR, degP and sRNAs such as MicA and CpxQ. On the other hand, it was observed that the increased levels of sRNAs MicA and CpxQ exhibited by the WT strain under NaCl treatment were significantly decreased in the Δhfq strain under the same conditions. Likewise, dysregulation in the expression of bacterial envelope homeostasis- related genes ompA/F/C, skp, lpp, rpoE and cpx was observed in the Δhfq strain. Taken together, these results indicate that the Δhfq strain exhibits several altered phenotypes related to envelope homeostasis, as well as resistance to osmotic stress, suggesting a global role for Hfq in the response to NaCl-triggered envelope stress.