Antisepsis is the process that results in reduction of microorganisms present in tissues by the use of antiseptics, the more used are those which have iodophors, chlorehxidine and alcohol. Chlorexhidine is widely used and recommended as a topical antiseptic but resistance reports to these antiseptic are becoming common and strategies are needed either to maximize the effect or development of new formulations to follow the mechanisms of acquired resistance of bacteria. We have in the nanoparticles an alternative, since the development of formulations with microbicide or microstatic effect is an option to conventional formulations with free molecule. The aim of this study was the characterization of an 0,25% aqueous-based chlorhexidine nanoemulsion (NM-Cl) and to evaluate by in-vitro and in vivo study its antiseptic effect. The NM-Cl presented adequate physicochemical characteristics for a nanoemulsion and presented antiseptic effect in the microdilution study, having the best effect between the tested formulations. In the Kill curve study there was a slower effect of the nanoemulsions but that was maintained for longer time when compared to chlorhexidine with free molecule. The nanoemulsion groups four-fold of MIC were the formulations with the most durable effect of those tested, presenting residual effect until T6 for both bacteria tested. At the in vivo study both formulations had a reduction of the microorganisms in the skin of the rats (p <0.0001) and as no difference of action was detected between the formulations in the tested times, we demonstrated the effect of the NM-Cl as an antiseptic (p > 0,05). NM-Cl presented satisfactory results at in vitro and in vivo tests despite being a formulation with lower concentration of chlorexhidine than the commercial formulation that is recommended for pre-surgical antisepsis. With this results, we have a nanostructured formulation with adequate physicochemical characteristics, antiseptic effect and residual antiseptic effect that are even better than the formulation with free molecule in the in vitro study and similar in vivo assay. Due to different mechanism of action, the NM-Cl has potential to avoid the resistance mechanisms of bacteria, being an alternative for formulation with free molecule. The NM-Cl is a viable antiseptic and potentially cheaper formulation, because of the similar effect with lower concentration of chlorexhidine.Antissepsia é o processo que visa a redução dos micro-organismos presentes nos tecidos vivos a níveis seguros por meio da utilização de antissépticos. Os mais utilizados são aqueles que possuem na sua composição iodóforos, clorexidina e álcool. A clorexidina é amplamente utilizada e recomendada como antisséptico de uso tópico. Entretanto relatos de resistência a este antisséptico vem se tornando cada vez mais comuns, sendo necessárias estratégias para maximizar seu efeito ou desenvolvimento de novas formulações para reduzir a resistência adquirida das bactérias. Nanoformulações são uma alternativa as formulações convencionais de antissépticos já que é possível desenvolver formulações nanoestruturadas com efeito microbicida ou microstático. Por estas razões, buscou-se sintetizar, caracterizar e avaliar o efeito antisséptico e residual de nanoemulsão de base aquosa de clorexidina a 0,25% (NM- Cl). Foi testado o efeito antisséptico da NM-Cl mediante ensaios in vitro e in vivo. A NM-Cl apresentou características físico-químicas adequadas para uma nanoemulsão e no estudo pela técnica de microdiluição foi constatado o efeito antisséptico da formulação, apresentando o melhor efeito dentre as soluções testadas. Na Kill Curve houve uma ação mais lenta das nanoemulsões mas que foi mantida por mais tempo quando comparada a solução de clorexidina com a molécula livre. O grupo de quatro vezes a CIM NM-Cl foi a formulação com efeito mais duradouro dentre as formulações testadas, apresentando o efeito residual mais intenso e que persistiu até o T6 frente as bactérias testadas. No estudo in vivo ambas as formulações apresentaram redução na contagem de UFC após a realização da antissepsia na pele dos ratos (T1) (p < 0,0001) e como não foi verificada diferença de intensidade da ação entre as formulações durante os diferentes tempos, demonstramos o poder da nanoemulsão de clorexidina como antisséptico (p > 0,05). A formulação de NM-Cl apresentou resultados satisfatórios tanto in vitro quanto in vivo, com concentrações mais baixas de clorexidina que a do produto comercial recomendado para antissepsia pré-cirúrgica. Com isso, temos uma formulação nanoestruturada com características físico-químicas adequadas, efeito antisséptico e residual superiores in vitro e similares in vivo, evidenciando uma formulação alternativa a dos produtos comerciais. Devido a diferenças no mecanismo de ação, é uma formulação que pode evadir a resistência bacteriana à Clorexidina na formulação livre, sendo uma alternativa viável e potencialmente mais barata pois apresentou mesmo efeito em menor concentração.