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Expressão e purificação da proteína Corismato Sintaxe de Plasmodium falciparum a partir da otimização e síntese do gene para sistema procariótico.
Registro en:
LEANDRO, Teodoro. Expressão e purificação da proteína Corismato Sintaxe de Plasmodium falciparum a partir da otimização e síntese do gene para sistema procariótico. 2010. 76 f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2010.
Autor
Leandro, Teodoro
Honda, Eduardo Rezende
Institución
Resumen
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Mestrado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Rezende Honda. A malária é uma doença de grande importância epidemiológica em termos de
morbidade e mortalidade no mundo. O índice de resistência às drogas
antimaláricas vem aumentando gradativamente ao longo das últimas décadas. A
descrição de vias metabólicas exclusivas de Plasmodium está abrindo
perspectivas para desenvolvimento de novas drogas contra alvos moleculares
bem definidos. A via do chiquimato é uma dessas vias metabólicas, e nesta está
presente a enzima corismato sintase (CS) que catalisa a transformação de 5-
enolpiruvil chiquimato 3-fosfato em corismato, último precursor comum na
biossíntese de compostos aromáticos, presentes em bactérias, fungos, plantas,
protozoários apicomplexa e ausente em mamíferos. A síntese e otimização do
gene da proteína (PfCS) foi necessária para expressão em sistema procarioto. O
produto gênico liofilizado foi inserido em vetor de clonagem PUC57 e vetor de
expressão pGS21a. O plasmídeo foi transformado em células competentes TOP
10 F’, em seguida realizou-se miniprep e confirmação com enzimas de restrição
Ncol e SalI. A retransformação foi realizada em células competentes BL 21 DE3
pLys e a indução foi com IPTG. A expressão foi confirmada por gel de SDSPAGE.
A etapa de purificação foi realizada com Kit Qiagen 6x Histidina em coluna
de Ni-NTA. A expressão foi obtida na forma de proteína recombinante de fusão
com histidina, assumindo a forma de corpúsculos de inclusão, que foram
desnaturadas com uréia 8M. Após purificação por coluna de afinidade obtivemos
um nível aceitável de pureza. Estamos trabalhando para expressar essa proteína
na forma solúvel e também em protocolos de renovelamento. Estudos in vitro
englobando teste da atividade e inibição enzimática utilizando extratos vegetais
encontrados na região Amazônica poderão identificar novos potenciais de
fármacos para o tratamento da malária, inicialmente P. falciparum.