Dissertação
Estudo da atividade de mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) em substratos celulósicos por espectromeria de massas
Registro en:
TEIXEIRA, Tallyta Santos. Estudo da atividade de mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) em substratos celulósicos por espectromeria de massas.2018.122f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Gurupi, 2018.
Autor
Teixeira, Tallyta Santos
Institución
Resumen
The lytic polysaccharides monooxygenases (LPMOs) are accessory enzymes that help the action of
hydrolytic enzymes in the deconstruction of the plant cell wall. The synergism of these enzymes
facilitates the obtaining of sugar monomers that are fundamental for microbial metabolism and for
industrial processes. The characterization of LPMOs is challenging, since it acts on cellulose and other
polysaccharides through oxidative cleavage, resulting in different types of oligomers. Therefore, it is
necessary to use advanced analytical techniques such as mass spectrometry that allows the
identification of chemical compounds from the m/z ratio (mass-charge). Thus, this work had as
objective to evaluate the action of the LPMO of Thermobifida fusca (TfAA10) recombinant in
cellulosic substrates by mass spectrometry. Two gene constructs were evaluated for LPMO activity: 1)
TfAA10-O (with optimized codon) and 2) TfAA10-N (with native codon), being expressed in
Khomagatella phaffi (Pichia pastoris). TfAA10-O was produced in Erlenmeyer (250 mL), while the
TfAA10-N in Erlenmeyer (250 mL) and bioreactor (1 L). The profiles of these enzymes were analyzed
by MALDI-TOF MS, using synapylic acid and positive linear mode, in which two isoforms were
observed, that is, two proteins that from the same sequence have different molecular sizes (27 and 24
kDa). The activities of the LPMOs were evaluated on cellulosic substrates (Avicel PH101 and PASC),
having ascorbic acid as an electron donor, and controls in the presence and absence of enzyme and/or
ascorbic acid. The reaction conditions and the analytical methods were optimized to allow the analysis
of the products of the enzymatic reaction. Among the reaction conditions evaluated are: buffers,
enzyme and ascorbic acid concentrations, agitation, purification form and substrate. The analytical
method by MALDI-TOF MS was optimized for the instrumental parameters and the sample
preparation method, since the LC-MS method was developed based on the literature and optimized
with oligosaccharide standards. Even after the optimization of the methods, in none of the conditions
tested was it possible to detect oxidized oligosaccharides that confirm the action of the LPMOs
studied. Despite this, several pieces of information were relevant to the study of the action of these
enzymes. Regarding the reaction conditions, potassium buffers were not feasible for hydrolysis
analysis of LPMOs due to the possibility of generating false positives. In these cases, ammonium or
sodium buffers were indicated. In the MALDI-TOF MS analyzes, the addition of sodium chloride was
adequate to allow a greater intensity of the oligosaccharides and also to avoid the erroneous
interpretation of potassium oxidized sodium and non-oxidized oligosaccharides, which have the same
m / z value. Doping of samples containing lithium, potassium and / or sodium salts may help to reveal
the identity of these ions, allowing the presence of oxidized oligosaccharides in low concentration by
the action of ascorbic acid, thus evidencing the necessity of the controls. TfAA10-N produced in
bioreactor showed native oligosaccharides with lower degree of polymerization (DP2-DP4)
throughout the reaction times, in acetate and sodium phosphate buffers. This result was observed in
the presence of the enzyme (with and without ascorbic acid), when analyzed by the two analytical
methods, suggesting a hydrolytic action under the conditions tested. The MALDI-TOF MS method
allowed the analysis of oligosaccharides with a higher degree of polymerization (DP3-DP9), while the
UHPLC-ESI-MS method showed adequate for smaller oligosaccharides (DP1-DP4) and also for more
complex sample analyzes. Thus, the analytical methods were shown to be complementary for the
characterization of LPMOs, which may help to guide the applications of this enzyme. And this study
showed that the TfAA10A expressed in K. phaffii shows no activity in cellulose (Avicel and PASC)
probably due to the glycosylation pattern that it presents. Only native oligosaccharides were detected,
which may be related to internal cleavage, but are not sufficient to prove the action of this LPMO. As mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são enzimas acessórias que auxiliam a ação
de enzimas hidrolíticas na desconstrução da parede celular vegetal. O sinergismo dessas enzimas
facilita a obtenção de monômeros de açúcares que são fundamentais para o metabolismo microbiano e
para processos industriais. A caracterização das LPMOs é desafiadora, pois ela atua na celulose e em
outros polissacarídeos através de clivagem oxidativa, resultando em diferentes tipos de oligômeros.
Por isso, se faz necessário utilizar técnicas analíticas avançadas como a espectrometria de massas que
permite a identificação de compostos químicos a partir da relação m/z (massa-carga). Dessa forma,
este trabalho teve como objetivo avaliar a ação da LPMO de Thermobifida fusca (TfAA10)
recombinante em substratos celulósicos por espectrometria de massas. Duas construções gênicas
foram avaliadas quanto à atividade de LPMO: 1) TfAA10-O (com códon otimizado) e 2) TfAA10-N
(com códon nativo), sendo expressas em Khomagatella phaffi (Pichia pastoris). A TfAA10-O foi
produzida em erlenmeyer (250 mL), enquanto que a TfAA10-N em erlenmeyer (250 mL) e biorreator
(1 L). Os perfis destas enzimas foram analisados por MALDI-TOF MS, empregando ácido sinapílico e
modo linear positivo, no qual observou duas isoformas, ou seja, duas proteínas que a partir da mesma
sequência, possuem tamanhos moleculares diferentes (27 e 24 kDa). As atividades das LPMOs foram
avaliadas em substratos celulósicos (Avicel PH101 e PASC), tendo o ácido ascórbico como doador de
elétrons, e controles na presença e ausência de enzima e/ou ácido ascórbico. As condições reacionais e
os métodos analíticos foram otimizados para permitir a análise dos produtos da reação enzimática.
Dentre as condições reacionais avaliadas tem-se: tampões, concentrações de enzima e de ácido
ascórbico, agitação, forma de purificação e substrato. O método analítico por MALDI-TOF MS foi
otimizado quanto aos parâmetros instrumentais e ao método de preparo da amostra, já o método LCMS foi desenvolvido com base na literatura e otimizado com padrões de oligossacarídeos. Mesmo
após a otimização dos métodos, em nenhuma das condições testadas foi possível detectar
oligossacarídeos oxidados que confirmem a ação das LPMOs estudadas. Apesar disso, diversas
informações foram relevantes para o estudo da ação dessas enzimas. Quanto as condições reacionais,
os tampões de potássio se mostraram inviáveis para análises de hidrólise de LPMOs pela possibilidade
de gerar falso-positivos, sendo indicados nestes casos os tampões de amônio ou sódio. Nas análises
por MALDI-TOF MS, a adição de cloreto de sódio se mostrou adequada por permitir maior
intensidade dos oligossacarídeos e também evitar a interpretação errônea de oligossacarídeos oxidados
sodiados e não oxidados potassiados, que possuem mesmo valor m/z. O dopping de amostras contendo
íons duvidosos com sais de lítio, potássio e/ou sódio podem auxiliar a revelar a identidade desses íons,
permitindo verificar a presença de oligossacarídeos oxidados, em baixa concentração pela ação do
ácido ascórbico, evidenciando assim a necessidade dos controles. A TfAA10-N produzida em
biorreator apresentou oligossacarídeos nativos com menor grau de polimerização (DP2-DP4) ao longo
dos tempos reacionais, nos tampões de acetato e de fosfato de sódio. Esse resultado foi observado em
ensaios na presença da enzima (com e sem ácido ascórbico), quando analisada pelos dois métodos
analíticos, sugerindo uma ação hidrolítica nas condições testadas. O método MALDI-TOF MS
permitiu a análise de oligossacarídeos com maior grau de polimerização (DP3-DP9), enquanto o
método UHPLC-ESI-MS mostrou adequado para oligossacarídeos menores (DP1-DP4) e também para
análises de amostras mais complexas. Dessa forma, os métodos analíticos se mostraram ser
complementares para a caracterização das LPMOs, podendo assim auxiliar no direcionamento das
aplicações desta enzima. E este estudo mostrou que a TfAA10A expressa em K. phaffii não apresenta
atividade em celulose (Avicel e PASC) provavelmente devido ao padrão de glicosilação que esta
apresenta. Apenas oligossacarídeos nativos foram detectados, que podem estar relacionados à
clivagem interna, mas que não são suficientes para comprovar a ação desta LPMO.