Tese
Avaliação in vitro da resposta inflamatória e metabolismo lipídico de macrófagos em animais taurinos e zebuínos estimulados com saliva do carrapto Rhipicephalus microplus
Autor
Paiva, Raquel Morais de
Institución
Resumen
The parasitism caused by Rhipicephalus microplus tick generates large
losses in meat and milk production by cattle, as well as representing a unique health
hazard due to the transmission of infectious diseases and the contamination of food
and environment caused by acaricides, the main methodology adopted by producers
for this hematophagous ectoparasite control. The phenotypic features of resistance
and susceptibility to R. microplus are well defined between the zebu (Bos primigenius
indicus) and taurine (Bos primigenius taurus) cattle breeds respectively, constituting a
multifactorial genetic inheritance of variable heritability. Several papers have already
identified the role of innate immunity and macrophage response against ticks. Despite
this, little is known about the different phenotypes of macrophages M1
(proinflammatory activity, Th1 inducer) and M2 (regulatory activity, Th2 inducer), and
its influences on tick resistance presented by taurine and zebu cattle. In this context,
the present work aims to characterize the metabolic pathways involved in the activation
of taurine and zebu macrophages to identify potential targets for metabolic
reprogramming by immunomodulation and candidate genes for bovine genetic
improvement programs. For this purpose, a macrophage differentiation protocol was
established from in vitro isolation of peripheral blood monocytes of taurine (Holstein)
and zebu (Gir) animals. The cells were treated with lipopolysaccharide (LPS), a potent
inducer of M1 macrophages, and R. microplus tick saliva, which under parasitism
conditions, is inoculated into the host to modulate the immune response and facilitate
hematophagy. The RNA of differentiated macrophages were extracted and submitted
to high throughput sequencing (RNA-Seq) for the identification of differentially
expressed genes (DEGs). Gene ontology and metabolic pathways analysis showed
that zebu non-stimulating macrophages have a greater activation of genes linked to
the antigen processing and presentation, the activation of the NFκB transcription factor
and the indirect control of the cell cycle through lipid metabolism. This macrophages
implication, with more proinflammatory responses for zebu animals, seems to directly
influence the M1 phenotype activation via LPS with a greater expression of genes
related with nitric oxide synthesis, cytokines, such as IL-1 and IL-36, besides the
NFκB2 factor, responsible in controlling the pro-inflammatory molecules transcription.
The saliva of R. microplus tick induced significant differences in mitotic activation
pathways and membrane potential regulated by oxidative stress. In addition, saliva
demonstrated the ability in modulating the expression of genes encoding the nitric
oxide synthase 2 enzyme (NOS2), the negative regulator of reactive oxygen species
(NRROS), and the IL-10 cytokine in LPS-stimulated macrophages, evaluated by real
time PCR. Taken together, these results, allowed us to identify candidate genes for
tick resistance in breed genetic programs, as well as key biological process, which can
be modulated for development of more effective strategies and less polluting tick
control. O parasitismo pelo carrapato Rhipicephalus microplus gera grandes perdas
na produção de carne e leite por bovinos, além de representar um perigo para a saúde
única, tanto pela transmissão de doenças infecciosas quanto pela contaminação do
alimento e meio ambiente por acaricidas, principal metodologia adotada por produtores
para controle de infestações por esse ectoparasito hematófago. As características
fenotípicas de resistência e susceptibilidade ao R. microplus são bem definidas entre
as raças de bovinos zebuínas (Bos primigenius indicus) e taurinas (Bos primigenius
taurus), respectivamente, constituindo uma herança genética multifatorial de
herdabilidade variável. Diversos trabalhos já identificaram a participação da imunidade
inata e resposta de macrófagos no desenvolvimento de resistência contra a infestação
por carrapatos. Apesar disso, até o momento, pouco se sabe acerca dos diferentes
fenótipos de macrófagos, M1 (atividade pró-inflamatória; indutor de padrão Th1) e M2
(atividade regulatória; indutor de Th2), e sua influência na resistência ao carrapato
apresentado por animais taurinos e zebuínos. Nesse contexto, o presente trabalho visa
caracterizar as vias metabólicas envolvidas na ativação de macrófagos de animais
taurinos e zebuínos para identificação de potenciais alvos de reprogramação
metabólica por imunomodulação e genes candidatos para programas de melhoramento
genético bovino. Para tal, foi estabelecido um protocolo de diferenciação de macrófagos
a partir de monócitos isolados de sangue periférico de animais taurinos (Holandês Preto
e Branco) e zebuínos (Gir), in vitro. Essas células foram estimuladas com
lipopolissacarídeo, um potente indutor de macrófagos M1, e saliva do carrapato R.
microplus que, em condições de parasitismo, é inoculada no hospedeiro para modular
a resposta imune e facilitar a hematofagia. O RNA de macrófagos diferenciados foi
extraído e submetido ao sequenciamento em massa (RNA-Seq) para identificação de
genes diferencialmente expressos (DEGs). Análises de ontologia gênica e rotas
metabólicas demonstraram que macrófagos de animais zebuínos, sem estímulo,
possuem uma maior ativação de genes ligados ao processamento e apresentação de
antígenos, à ativação do fator de transcrição NFκB e ao controle indireto do ciclo celular
através do metabolismo de lipídeos. Esse comprometimento com respostas mais próinflamatórias
apresentado por macrófagos de animais zebuínos parece influenciar
diretamente na ativação do fenótipo M1 via LPS com uma maior expressão de genes
relacionados a síntese do óxido nítrico, de citocinas, como IL-1 e IL-36, além do fator
NFκB2, que é responsável pelo controle da transcrição de moléculas com atividade próinflamatória.
A saliva de R. microplus induziu diferenças significativas em vias de
ativação da mitose e do potencial de membrana regulados pelo estresse oxidativo.
Além disso, a saliva demonstrou capacidade de modular a expressão dos genes que
codificam a enzima óxido nítrico sintase 2 (NOS2), o regulador negativo de espécies
reativas de oxigênio (NRROS), e a citocina IL-10 em macrófagos estimulados com LPS,
avaliados por PCR em tempo real. Esses resultados, em conjunto, permitiram indicar
genes candidatos para resistência ao carrapato em programas de melhoramento
genético bovino bem como processos biológicos chave, passíveis de modulação, para
desenvolvimento de estratégias mais eficazes e menos poluentes de controle do
carrapato.