Dissertação
Investigação da apoptose plaquetária induzida por heme e pela hemozoína na malária vivax
Autor
Fontes, Thayane Modesto
Institución
Resumen
Malaria is a disease caused by the Plasmodium parasite that is transmitted by the
Anopheles mosquito. Although most cases of malaria in the world are caused by P.
falciparum, in Brazil most reports are due to infections by P. vivax. Vivax malaria has
long been neglected as it was considered a benign infection, but severe forms and
complications of the disease, including a sudden drop in platelet count, have been
reported. One of the hypotheses to explain thrombocytopenia is platelet apoptosis,
which may be induced by stimuli released during infection. To understand whether
factors released during vivax malaria were inducing platelet apoptosis, platelets from
healthy donors were incubated with plasma from patients infected with P. vivax. It
was observed that patient plasma induced the apoptotic phenotype in platelets,
evidenced by phosphatidylserine exposure, inner mitochondrial membrane
depolarization, and cell shrinkage. It has been shown that heme and hemozoin, two
toxins released after the lysis of infected red blood cells, induce apoptosis in
trophoblast cells and astrocytes. However, heme- and hemozoin-induced platelet
apoptosis has not yet been described. To investigate this, platelets from healthy
volunteers were incubated with heme or synthetic hemozoin (sHz) and it was
observed that both heme and sHz induced platelet apoptosis. Since the antagonistic
balance between pro and anti-apoptotic proteins regulates apoptosis and the
degradation of Bcl-xL in response to heme was recently evidenced by our group, we
investigated which protein degradation pathway, proteasome or calpains, would be
involved in this process. Platelets from healthy donors were then pretreated with the
proteasome inhibitor, Bortezomib, or the calcium chelator, Bapta-AM, prior to
stimulation with heme and sHz. We observed that treatment with Bortezomib or
Bapta-AM was not able to prevent platelet apoptosis induced by heme and sHz.
Finally, the addition of hemopexin, a heme chelator, reversed the apoptotic effect of
plasma from vivax malaria patients on platelets, suggesting the involvement of heme
in platelet apoptosis. Our results therefore indicate that heme and hemozoin toxins,
through the induction of platelet apoptosis, may be contributing to the
thrombocytopenia observed in vivax malaria. A malária é uma doença causada pelo parasita Plasmodium que é transmitido pelo
mosquito Anopheles. Ainda que a maior parte do casos de malária no mundo sejam
causados pelo P. falciparum, no Brasil a maioria das notificações se devem a
infecções por P. vivax. A malária vivax foi por muito tempo negligenciada pois era
considerada uma infecção benigna, porém têm sido relatadas formas graves e
complicações da doença, incluindo diminuição abrupta na contagem de plaquetas.
Uma das hipóteses para explicar a plaquetopenia é a apoptose plaquetária, que
pode estar sendo induzida por estímulos liberados durante a infecção. Para
compreender se fatores liberados durante a malária vivax estariam induzindo a
apoptose plaquetária, plaquetas de doadores sadios foram incubadas com plasma
de pacientes infectados por P. vivax. Foi observado que o plasma de pacientes
induziu o fenótipo apoptótico nas plaquetas, evidenciado pela exposição de
fosfatidilserina, despolarização da membrana mitocondrial interna e encolhimento
celular. Já foi demonstrado que o heme e a hemozóina, duas toxinas liberadas após
a lise de hemácias infectadas, induzem a apoptose em células do trofoblasto e em
astrócitos. Contudo, a apoptose de plaquetas induzida por heme e hemozóina ainda
não foi descrita. Para investigar isso, plaquetas de voluntários saudáveis foram
incubadas com heme ou hemozoína sintética (sHz) e foi observado que tanto heme
quanto a sHz induziram a apoptose plaquetária. Uma vez que o balanço antagônico
entre proteínas pró e anti-apoptóticas regula a apoptose e que a degradação de BclxL em resposta ao heme foi recentemente evidenciada pelo nosso grupo,
investigamos qual via de degradação de proteínas, proteassoma ou calpaínas,
estaria envolvida nesse processo. Plaquetas de doadores sadios foram então prétratadas com o inibidor de protessoma, Bortezomib, ou com o quelante de cálcio,
Bapta-AM previamente ao estímulo com heme e sHz. Observamos que o tratamento
com Bortezomib ou Bapta-AM não foi capaz de impedir a apoptose plaquetária
induzida por heme e sHz. Finalmente, a adição de hemopexina, um quelante de
heme, reverteu o efeito apoptótico do plasma de pacientes com malária vivax sobre
as plaquetas, sugerindo o envolvimento do heme na apoptose plaquetária. Nossos
resultados indicam portanto que as toxinas heme e hemozoina, através da indução
da apoptose plaquetária, podem estar contribuindo para a plaquetopenia observada
na malária vivax. CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior