A resistência aos antimicrobianos é um desafio mundial já declarado por diversos órgãos e se dá, principalmente, devido ao uso indiscriminado dessas drogas. Sistemas de efluxo multidrogas são transportadores de membrana que podem expelir antimicrobianos de diferentes classes conferindo multirressitência a seus hospedeiros e estão também envolvidos na formação de biofilmes. Assim, os objetivos do presente trabalho incluíram compreender o papel desempenhado por SEM na resistência aos antimicrobianos em Staphylococcus aureus e Escherichia coli multirresistentes, detectar sua atividade e investigar seu envolvimento na formação de biofilmes nesses micro-organismos. Após seleção de S. aureus e E. coli MDR de diferentes origens, foi detectada a presença de genes de SEM por PCR, as concentrações inibitórias mínimas (MICs) de alguns antimicrobianos foram determinadas na presença e ausência de inibidores de SEM, bem como a formação de biofilme pelos isolados nessas duas condições. Ainda, verificou-se o efluxo de corantes fluorescentes para demonstração de atividade de SEM. Ao final, traçou-se a relação filogenética dos isolados com o auxílio da PFGE. Os genes de SEM estão amplamente difundidos entre S. aureus e E. coli multirresistentes. Cerca de 20% dos isolados de E. coli tiveram redução na MIC de ampicilina e ciprofloxacina. Em S. aureus não houve redução na MIC de ciprofloxacina e tetraciclina. Utilizando efluxo de corantes, aproximadamente 79% dos isolados de E. coli demonstraram atividade de SEM, enquanto 56% de S. aureus o fizeram. O uso de inibidor de SEM não reduziu a formação de biofilme em E. coli mas a reduziu em S. aureus. Quanto à epidemiologia molecular, os isolados de E. coli recuperados de humanos apresentaram um padrão mais diverso, enquanto aqueles obtidos de animais foram mais homogêneos. S. aureus de maneira geral foram mais homogêneos, com similaridade superior a 84% dentro dos clusters. A atividade de SEM é relevante entre bactérias multirresistentes, porém as tentativas de inibição não culminaram em restituição da sensibilidade, provavelmente devido a ocorrência de outros mecanismos de resistência simultaneamente. Em relação à formação de biofilmes, resultados controversos foram encontrados, e novos estudos com diferentes concentrações do inibidor são sugeridos para conclusões mais contundentes. Além disso, a complementação desses resultados com estudos de sequenciamento completo dos isolados, já em execução, pode fornecer novas pistas para o esclarecimento do papel de SEM na resistência antimicrobiana e na formação de biofilmes em isolados multirresistentes. Palavras-chave: Bombas de efluxo. Resistência aos antimicrobianos. Adesão. Escherichia coli. Staphylococcus aureus.Antimicrobial resistance is a global challenge that has already been developed by several agencies and is mainly due to the discriminatory use of drugs. Multidrug efflux systems (MES) are membrane transporters that can expel antimicrobials of different classes conferring multidrug resistance (MDR) to their hosts and are also involved in the formation of biofilms. Thus, the objectives of the work include understanding the role played by MES in the resistance to antimicrobials of Staphylococcus aureus and Escherichia coli, detecting their activity and investigating their involvement in the formation of biofilms in these microorganisms. After selection of S. aureus and E. coli MDR from different origins, the presence of MES genes was detected by PCR, the minimum inhibitory concentrations (MICs) of some antimicrobials were determined in the presence and absence of SEM inhibitors, as well as the biofilm formation by the isolates under these two conditions. In addition, the efflux of fluorescent dyes was measured to demonstrate MES activity. At the end, the phylogenetic relationship of the isolates was traced with the aid of PFGE. MES genes are widespread among multidrug resistant S. aureus and E. coli. About 20% of the E. coli isolates had a reduction in the MIC of ampicillin and ciprofloxacin. In S. aureus there was no reduction in the MIC of ciprofloxacin and tetracycline. Using dye efflux, approximately 79% E. coli isolates had MES activity, while 56% S. aureus did. The use of SEM inhibitor did not reduce biofilm formation in E. coli but reduced it in S. aureus. Regarding molecular epidemiology, E. coli isolates recovered from humans showed a more diverse pattern, while those obtained from animals were more homogeneous. S. aureus were generally more homogeneous, with similarity greater than 84% within the clusters. MES activity is relevant among multidrug-resistant bacteria, however, attempts at MES inhibition did not lead to the restoration of resistance, probably due to the occurrence of other resistance mechanisms simultaneously. Regarding the combination of biofilms, controversial results were found and new studies with different concentrations of the inhibitor are suggested for stronger conclusions. Furthermore, a complementation of these results with studies of whole genome sequencing of the isolates, already running, may provide new clues to clarify the role of MES in antimicrobial resistance and in the formation of biofilms in multidrug-resistant isolates. Keywords: Efflux pumps. Antimicrobial resistance. Adhesion. Escherichia coli. Staphylococcus aureus.