Pfaffia glomerata is a plant whose importance comes to the active constituent 20- hydroxiecdysone (20E), an important phytoecdisteroid. 20E is similar to insect molting hormones, however, it is still poorly understood how plants produce 20E. Here, the content of 20E in P. glomerata was assessed in plants grown under in vitro photoautotrophic conditions or challenged with the nematode Meloidogyne javanica, under greenhouse conditions. The aim of this work was understand the biosynthesis of 20E in two accessions of P. glomerata (Ac 22 and 43) by means of metabolomics, ultrastructure and expression of two 20E biosynthesis-related genes. We verified that photoautotrophy system was efficient to stimulate the production of 20E under CO2 enrichment (1000 μL L-1) combined with Florialite® as supporting material. Florialite® led to well-developed chloroplast strucuture and increasing of morphometric measures. Interestingly, the photoautotrophic system influenced on photosynthesis intermediates (amino acids, sugars, and TCA), stress-(aromatic amines and shikimate), osmotic adjustment-related compounds (hydroxyproline, aspartate and myo-inositol). Markedly, urea seems to be a biomarker for low photoautotrophic conditions. The nematodes reduced many central metabolites of Ac 43 (notably organic acids), and accumulated important amino acids for nematode nutrition (isoleucine and valine). Ac 22, by its turn, accumulated sugars that are stress indicators and closely involved on the maturation of the nematodes. Notwithstanding, the Halloween genes (Phantom and Spook), only reported in insects, were expressed in P. glomerata and were influenced by nematode interaction, increasing expression on Ac 43 infected by nematode and increasing content of 20E. Conversely, Phantom and Spook were downregulated in Ac 22 infected with nematodes. The infection of nematode causes damage-induced accumulation of 20E in accessions of Pfaffia glomerata and that accumulation was modulated by the phantom and spook genes and by differences on metabolome. We infered that metabolism of Pfaffia glomerata accessions 22 and 43 is characterized by distinct metabolic signatures under photoautrophic system and with nematode interaction.Pfaffia glomerata é uma planta cuja importância provém do princípio ativo 20- hidroxiecdisona (20E), um importante fitoecdiesteroide. 20E é similar aos hormônios de muda dos insetos, entretanto ainda é pouco claro como as plantas produzem 20E. Nesse trablho, o teor de 20E em P. glomerata foi avaliado em plantas crescido sobre condições fotoautotrófica in vitro ou desafiadas com o nematoide Meloidogyne javanica sob condições de casa de vegetação. O objetivo desse trabalho foi entender a biossíntese de 20E em dois acessos de P. glomerata (Ac 22 e 43) por meio da metabolômica, ultraestrutura e expressão de dois genes relacionados a biossíntese de 20E. Foi verificado que o sistema fotoautotrófico foi eficiente no estímulo da produção de 20E sobre enriquecimento de CO2 (1000 μL L-1) combinado com Florialite® como material de suporte. Florialite® permitiu um melhor desenvolvimento da estrutura do cloroplasto e aumentou medidas morfométricas. Curiosamente, o sistema fotoautotrófico influencioi nos intermediários da fotossíntese (aminoácidos, açucares e TCA), compostos relacionados ao estresse (aminas aromáticas e ácido chiquímico), ao ajustamento osmótico (hidroxiprolina, ácido aspártico e mio-inositol). Notavelmente, ureia parece ser um biomarcador para baixas condições fotoautotróficos. Os nematoides reduziram muito metabólitos centrais do Ac 43 (particularmente ácidos organicos) e acumulou importantes aminoácidos importantes para nutrição do nematoide (isoleucina e valina). Ac 22 por sua vez, acumulou açucares que são indicadores de estresse e intimamente relacionados à maturação dos nematoides. Não obstante, os Halloween genes (Phantom e Spook), somente reportado em insetos, foram expressos em P. glomerata e foram influenciados pela interação com nematoides, aumentando sua expressão no Ac 43 quando infectado pelo nematoide e aumentando o teor de 20E. Por outro lado, Phantom e Spook foram regulados abaixo no Acesso 22 infectado por nematoide. A infecção por nematoides causa acúmulo de 20E induzido por danos nos acessos de Pfaffia glomerata e esse acúmulo, foi modulado pelos Phantom e Spook e pelas diferenças no metaboloma. Pode-se inferir que o metabolismo dos acessos 22 e 43 de Pfaffia glomerata é caracterizado por padrões metabólicos distintos sob sistema fotoautotrórico e na interação com nematoide. We infered that metabolism of Pfaffia glomerata accessions 22 and 43 were characterized by distinct metabolic signatures under photoautrophic system and with nematode interaction.