Tese
RGS1 phospho-barcode: decoding how G signaling is modulated in plants through the phosphorylation of its components
Código de barras de fosforilação de RGS1: decodificando como a sinalização G é modulada em plantas por meio da fosforilação de seus componentes
Registro en:
OLIVEIRA, Célio Cabral. RGS1 phospho-barcode: decoding how G signaling is modulated in plants through the phosphorylation of its components. 2022. 75 f. Tese (Doutorado em Bioquímica Aplicada) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2022.
Autor
Oliveira, Célio Cabral
Institución
Resumen
Plants activate complex mechanisms of cellular signaling in response to environmental changes. Thus, signaling pathways controlled by the heterotrimeric G protein play an essential role. The G complex is composed of one guanine nucleotide-binding alpha subunit, one beta and one gamma. In spite of the fact that those proteins were conserved in eukaryotes during the evolution process, plants, algae, and protists, as well as organisms at the evolutionary base, possess self-activating alpha subunits with an accelerated GDP-to-GTP exchange activity at its catalytical domain. Thus, self-activating proteins differ from their orthologs at the activation level that is not controlled by G-protein coupled receptors (GPCRs). Instead, those are regulated by RGS (regulator of G-signaling) proteins with a seven-transmembrane (7TM) domain. Differently from the classical switching mechanism via the GTP/GDP state of Gα, the post- translational modifications on G-core components add a new layer of sensitization, discrimination of recognized stimulus, and propagation of stimulus signaling, which defines a four-state model of G-protein activation. Although several phosphorylation sites have already been identified, the underlying mechanisms and the specificity of each of them on signaling pathways are not fully elucidated. Therefore, to shed a light on this additional control layer in G-protein regulation, as well as on the mechanism of its regulator RGS, we used the model organism Arabidopsis thaliana and evaluated the effect of phosphorylation in the G subunits in the signal activation and distinction upon different conditions. In the first chapter, we have crossed in vivo and in vitro phosphorylation data of canonical and non-canonical subunits, and we highlight the phosphosite conservation among eukaryotes. We pointed out the kinase receptors involved and the potential effect of those modifications on signal plasticity. In the second chapter, through site-direct mutagenesis, we generated phosphomimetics and phosphonull mutants of AtRGS1 residues that presented higher conservation among species and were previously identified by their phosphorylation. Thus, we evaluated the central role of those residues in interacting with G complex proteins and with possible adaptors involved in its subcellular localization. These data, taken together with confocal microscopy results, immunodetection methods, and state-of-the-art protein structural modeling tools, reveal a phosphorylation mechanism that is possibly conserved in plants, in which multiple residues are phosphorylated in a cooperative manner to respond to different stimuli. Several lines of evidence suggest that the serine 278 residue is an essential modulator of RGS1 function and its signaling pathways. First, mutation on the serine residue to glutamic acid significantly decreases the interaction of RGS with G complex proteins and VPS26b (Vacuolar Protein Sorting 26). Second, the RGS internalization process upon flg22 stimulus requires the 278 residue phosphorylation, which is only partially required upon UDP-glucose stimulus. Third, phosphonull S278A mutation decreases the VPS26 proteins recruitment upon flg22 elicitation. Finally, the serine residue 278 is considerably conserved in a flexible protein region, and it regulates the phosphorylation levels of C-terminal tail residues, and one or more threonine residues that are detected for the first time in vivo. Moreover, molecular dynamics simulations evidenced the effect of this residue on domain positioning and flexibility of other regions. Accordingly, this work presents the relevance of post-translational modifications in the signal distinction triggered by G protein signaling, in addition to demonstrating the influence of those modifications on the structural alterations in the RGS proteins, which control their specific stimulus responses. Keywords: RGS. Phosphorylation. Flg22. G-protein. 7TM. Plantas desencadeiam complexos mecanismos de sinalização celular em respostas a variações ambientais. Neste contexto, vias controladas por proteínas G heterotriméricas desempenham um papel extremamente importante. O complexo G é composto por uma subunidade alfa que se liga a nucleotídeos de guanina, uma subunidade beta e uma subunidade gama. Apesar destas serem conservadas em eucariotos durante o processo evolutivo, plantas, algas verdes e protistas, assim como organismos da base evolutiva, apresentam subunidades alfa capazes de autoativação por meio da troca acelerada de GDP por GTP em seu domínio catalítico. Assim, as proteínas autoativadoras diferem de seus ortólogos na regulação em que, ao invés de serem controladas ao nível de ativação por receptores acoplados a proteínas G (GPCRs), são reguladas através da aceleração da atividade GTPase por proteínas do tipo RGS (reguladores da sinalização G) que contém sete domínios transmembrana (7TM). Diferentemente do mecanismo clássico de ativação por meio da ligação de GTP/GDP em Gα, modificações pós- traducionais em componentes do complexo adicionam uma nova camada de sensibilização, discriminação e propagação de estímulos distintos, estabelecendo um modelo de quatro estados. Embora muitos sítios de fosforilação nos componentes já sejam identificados, os mecanismos envolvidos e a especificidade de cada um deles em vias de sinalização ainda não são elucidados. De maneira a avançar no entendimento deste controle nos componentes do complexo G, como também seu regulador RGS, utilizamos o organismo modelo Arabidopsis thaliana e avaliamos o efeito de fosforilação das subunidades G na ativação e distinção de sinal sob diferentes condições. No primeiro capítulo, convergimos dados de fosforilação in vivo e in vitro de subunidades canônicas e não canônicas, destacando a sua conservação entre eucariotos. Evidenciou-se os receptores do tipo cinase envolvidos e o possível efeito destas modificações na plasticidade de sinal. No segundo capítulo, por meio de mutação sítio dirigida foram gerados mutantes fosfomiméticos e fosfonulos nos resíduos de AtRGS1 que apresentam maior conservação entre espécies e que foram previamente identificados ser fosforilados. Assim, foi avaliado o papel destes resíduos na interação com proteínas do complexo G e com possíveis adaptadores envolvidos em sua localização subcelular. Estes dados, juntamente com dados de microscopia confocal, imunodetecção de proteínas e as mais modernas ferramentas de modelagem estrutural de proteínas, revelam um mecanismo de fosforilação possivelmente conservado em plantas em que múltiplos resíduos são fosforilados de maneira cooperativa e específica em resposta a diferentes estímulos. Por várias linhas de evidência identificamos o resíduo de serina 278 como importante modulador da função e sinalização mediada por RGS1. Primeiramente, a mutação do resíduo de serina para ácido glutâmico diminui significativamente a interação com proteínas do complexo G e VPS26b (Vacuolar Protein Sorting 26). Segundo, o processo de internalização de RGS1 mediante ao estímulo por flg22 requer a fosforilação do resíduo 278, enquanto, para UDP-glicose, este resíduo é parcialmente requerido. Terceiro, o mutante fosfonulo S278A diminui o recrutamento das proteínas VPS26 mediante a elicitação por flg22. Finalmente, este resíduo é consideravelmente conservado em uma região flexível da proteína capaz de regular o nível de fosforilação de resíduos presentes na cauda C-terminal de ARGS1, assim como de um ou mais resíduos de treonina detectados pela primeira vez in vivo. Além disso, em simulações de dinâmica molecular, nota-se o efeito deste resíduo no posicionamento de domínios e flexibilidade de regiões paralelas. Neste contexto, este trabalho apresenta a importância elevada de modificações pós-tradicionais na distinção de sinais desencadeados por sinalização de proteínas G, além de evidenciar a relação dessas modificações com alterações estruturais da proteína RGS1 e que governam suas repostas a estímulos específicos. Palavras-chave: RGS. Fosforilação. Flg22. Proteína G. 7TM. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior