Tese
Trichoderma spp. endofíticos de seringueiras nativas da floresta amazônica: identificação e caracterização de novas espécies e potencial para o controle de fungos fitopatogênicos
Endophytic Trichoderma spp. of native rubber trees of the amazon forest: identification and characterization of new species and potential for the control of phytopathogenic fungi
Registro en:
BRITO, Vanessa Nascimento. Trichoderma spp. endofíticos de seringueiras nativas da floresta amazônica: identificação e caracterização de novas espécies e potencial para o controle de fungos fitopatogênicos. 2017. 84 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2017.
Autor
Brito, Vanessa Nascimento
Institución
Resumen
Espécies do gênero Trichoderma estão entre os fungos mais estudados e comercializados como agentes de controle biológico na agricultura. Contudo, estudos envolvendo a análise de Trichoderma spp. endofíticos em plantas nativas da Amazônia brasileira são incipientes. Os fungos endofíticos são definidos como aqueles que vivem no interior de tecidos vegetais, convivendo com seus hospedeiros de maneira simbiótica e apresentam elevada diversidade em florestas tropicais. Os objetivos do presente estudo foram utilizar os marcadores moleculares IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism) e REMAP (Retrotransposon- Microsatellite Amplified Polymorphism) para a triagem dos isolados de Trichoderma spp., identificar esses isolados endofíticos de plantas de Hevea spp. nativas da floresta amazônica brasileira ao nível de espécie e caracterizar os isolados com potencial para utilização no controle biológico de fungos fitopatogênicos. Trinta e oito isolados de Trichoderma spp. foram analisados empregando os marcadores moleculares IRAP e REMAP. Os perfis de bandas produzidos demonstraram a redundância de alguns isolados obtidos do mesmo tecido e na mesma planta. Essa triagem permitiu a seleção de 30 isolados para a análise filogenética e a identificação. Para identificação ao nível de espécie foram utilizados os oligonucleotídeos específicos para amplificar o espaçador interno transcrito (ITS do rDNA), e dos genes do fator de elongação da tradução 1-alfa (TEF1-α), da subunidade alfa da actina (ACT) e da subunidade maior da RNA polimerase II (RPB2). A maioria dos isolados foram classificados em 11 espécies distintas, sendo quatro novas espécies propostas: Trichoderma sp. VIC 44362, Trichoderma sp. VIC 44361, Trichoderma sp. VIC 44364 e Trichoderma sp. VIC 44363. Estas novas espécies foram sustentadas filogeneticamente com valores de probabilidade à posteriori altamente suportados. A seleção dos isolados de Trichoderma spp. quanto ao seu potencial para o controle biológico de fitopatógenos (Colletotrichum karstii, C. laticiphilum, C. lindemuthianum e Fusarium verticillioides) foi realizada a partir de ensaios de cultura dupla, atividade antifúngica do filtrado liofilizado e do extrato bruto e atividade enzimática. Na análise de cultura dupla, os isolados 432F8C-AM (Trichoderma sp. VIC 44361), 763F25F-AM (Trichoderma sp. VIC 44362), 764F2C-AM (Trichoderma sp. VIC 44362), 762F17F-AC (Trichoderma sp. VIC 44362) e 26F9R-AC (T. ovalisporum) apresentaram os maiores potenciais de inibição dos quatro fungos fitopatogênicos. Para a análise do filtrado liofilizado, os isolados 17F5R-AM (Trichoderma sp. VIC 44363), 24F6C-AM (T. koningiopsis), 245F13C-AC (T. koningiopsis) e 763F25F-AM (Trichoderma sp. VIC 44362) destacaram-se na inibição dos quatro fitopatógenos, bem como, foram capazes de produzir quitinase e β-1,3-glucanase. O isolado 17F5R-AM (Trichoderma sp. VIC 44363) apresentou os melhores resultados em relação à inibição do crescimento micelial e a inibição da germinação dos conídios de todos os fitopatógenos testados, com concentrações mínimas inibitórias relativamente baixas em relação aos demais isolados testados. Os resultados demonstram que os marcadores moleculares IRAP e REMAP são eficientes para serem utilizados durante o processo de triagem para a seleção de isolados de Trichoderma spp. Além disso, a formação do dendograma mostrou uma relação com os resultados da análise filogenética, onde a maior parte dos grupos formados no dendograma representa espécies filogeneticamente próximas. O isolado 17F5R-AM (Trichoderma sp. VIC 44363) tem elevado potencial para ser utilizado no controle biológico dos fitopatógenos. Ressalta-se assim, que o isolamento e identificação de espécies endofíticas do gênero Trichoderma em plantas tropicais nativas podem revelar agentes novos e eficientes para controle de fitopatógenos, além de possibilitar a descoberta de novas espécies. Species of the genus Trichoderma are among the most studied fungi and marketed as agents of biological control agests in agriculture. However, studies involving the analysis of endophytic Trichoderma spp. in native plants of the brazilian amazon are incipient. Endophytic fungi are defined as those which live inside plant tissues in symbioses, and present high diversity in tropical forests. The objectives of the present study were first to use the molecular markers IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism) and REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) to select isolates of Trichoderma spp., for the phylogenetic analusis, seconde, to identify these isolates of endophytic plants of Hevea spp. native species of the brazilian amazon forest, and finally, to characterize the isolates with potential for use in the biological control of phytopathogenic fungi. Thirty-eight isolates of Trichoderma spp. were analyzed using the molecular markers IRAP and REMAP. The bands profiles produced also demonstrated the redundancy of some isolates obtained from the same tissue and in plant. This screening allowed the selection of 30 isolates for phylogenetic analysis and identification. For identification at the specie level, specific oligonucleotides were used to amplified the transcript internal spacer (rDNA ITS), translation elongation factor 1 alpha (TEF1-α), actin alpha subunit (ACT) and largest subunit of the RNA polymerase II (RPB2) sequences. Most of the isolates were classified in 11 distinct species and four new species proposed: Trichoderma sp. VIC 44362, Trichoderma sp. VIC 44361, Trichoderma sp. VIC 44364 and Trichoderma sp. VIC 44363. These new species were phylogenetically determined by highly supported posteriori probability values. The selection of Trichoderma spp. isolates with potential for the biological control of phytopathogens (Colletotrichum karstii, C. laticiphilum, C. lindemuthianum and Fusarium verticillioides) was selected base on the double culture tests, antifungal activity of lyophilized filtrate and crude extract and enzymatic activity. In the double-culture analysis the isolates 432F8C-AM (Trichoderma sp. VIC 44361), 763F25F-AM (Trichoderma sp. VIC 44362), 764F2C-AM (Trichoderma sp. VIC xii44362), 762F17F-AC (Trichoderma sp. VIC 44362) and 26F9R-AC (T. ovalisporum) have the highest potentials of inhibition to the four phytopathogenic fungi. For the analysis of the lyophilized filtrate the isolates 17F5R-AM (Trichoderma sp. VIC 44363), 24F6C-AM (T. koningiopsis), 245F13C-AC (T. koningiopsis) and 763F25F-AM (Trichoderma sp. VIC 44362) stood out in the inhibition of four phytopathogenic fungi, as well as, capable of producing chitinase and β-1,3-glucanase. Interestingly, the 17F5R-AM (Trichoderma sp. VIC 44363) isolate showed the best results regarding inhibition of mycelial growth and inhibition of conidial germination of all phytopathogens tested, with relatively low inhibitory concentrations in relation to the other isolates tested. The results demonstrate that the molecular markers IRAP and REMAP are efficient to be used during the screening process for the selection of Trichoderma spp. In addition, the formation of the dendogram showed a relationship with the results of phylogenetic analysis, where most of the groups formed in the dendogram represent phylogenetically close species. The 17F5R-AM (Trichoderma sp. VIC 44363) isolate has a high potential to be used in the biological control of phytopathogens. Highlighting, the isolation and identification of endophytic species of the genus Trichoderma in native tropical plants may reveal new and efficient agents for the control of phytopathogens, as well as the discovery of new species. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior