Arsenic (As) is a metalloid ubiquitously distributed in the environment. The presence of As in drinking water is a serious health problem in many countries due to its genotoxic and mutagenic effects. The cleanup of contaminated water and soils requires the use of appropriate remediation techniques to prevent possible impacts on the ecosystems. As- hyperaccumulating ferns provide the possibility of developing cost-effective, and ecofriendly As phytoremediation programs. Pteris vittata L. was the first As hyperaccumulating fern described, and has been widely studied. Pityrogramma calomelanos L. (Link) is a less known hyperaccumulating fern that grows naturally in As-contaminated sites. This study aimed to characterize the morphoanatomical and physiological mechanisms involved in As accumulation and tolerance in P. calomelanos. Three experiments (E1, E2 and E3) were performed using ferns at different stages of development and exposed to As (E1: 1 mM As; E2-E3: 1, 10, and 30 mM As) for two (E2) or three (E1 and E3) weeks. Arsenic was supplied as a solution of sodium arsenate and was added to Hoagland’s nutrient solution (1/2 strenght). Plants grown in solution without As were used as control. The chlorophyll (chl) a fluorescence was evaluated by Imaging-PAM fluorometer (E2) and Mini-PAM portable fluorometer (E3; only dark parameters), and the chl content was estimated by portable chlorophyll meter (SPAD) in E1. At the end of the experiments, plants were sampled for physiological (E1 and E3), microscopic (E2), chemical (E1-E3) and micro-energy dispersive X-ray fluorescence spectrometry (μ-EDXRF) (E1 and E3) analyses. Pityrogramma calomelanos showed a high potential to As uptake, translocation and accumulation. Arsenic concentrations in fronds ranged from 3000 to 12000 mg kg-1 dry weight (DW) and was higher in E3. Plants exposed to 1 mM As (E1), ferns accumulated As mainly in pinnae (75 % as arsenite), whereas roots and stipes showed similar As contents (95 % and 74 % as arsenate, respectively). Arsenic partition was similar between E1 and E2, whereas in E3, stipes and roots showed As concentrations higher than those found in pinnae at 10 and 30 mM As in solution. Arsenic reduced the P concentrations in ferns of E1, but not in those from E2 and E3. In E1, As reduced the content of K, Fe and Mg, and the translocation of K and S. Arsenic did not change chl content in plants from E1 and E3, however, differences were observed in chl a fluorescence of plants exposed to 10 and 30 mM (E2). Ferns showed reduction in DW of pinnae at 30 mM As (E2), and apical and marginal necrosis in old fronds at 10 and 30 mM As (E2 and E3). In an anatomic view, these ferns (E2: 10-30 mM As) showed increase in phenols (healthy pinna areas) and tissue disruption mainly in the pinnule margins and near the secondary veins (necrotic pinna areas). Arsenic induced slight alterations in the radicular system (E2), such as progressive darkening of the root, detachment of border-like cells, increase in cell wall thickness and accumulation of granular compounds in cortical cells at 30 mM As. The μ-EDXRF analysis confirmed that As was preferentially located in apical and marginal regions of pinnules and around the veins. Pityrogramma calomelanos showed an efficient antioxidant defense system, as observed by the increase in the activities of antioxidant enzymes (E1 and E3) and increase in non-protein thiols (E1), phenols (E2 and E3), and other scavenging molecules (E3), especially in pinnae. At extremely high As concentrations (e.g. 30 mM As) these protective mechanisms became inefficient, increasing the concentration of oxygen reactive species and culminating in lipid peroxidation in fronds (E3). Roots exposed to 1 mM As also showed increase in lipid peroxidation. In E3, As accumulation promoted reduction or maintenance of metabolites associated with central carbon metabolism (e.g. glucose) and increased the total concentration of amino acids and proteins. Amino acids up-regulated by As were associated with S metabolism, photorespiration, osmoprotection and secondary metabolite biosynthesis. Altogether, these findings indicate that P. calomelanos can be successfully used for remediation of moderate As-contaminated sites. Adult plants with higher biomass (e.g. 5-7 fronds - E3) are preferable due to their higher potential to extract As from the medium. Experiments with low-dose and long-time exposures (chronic exposure) are needed to clarify the dose-response-mediated mechanisms of As-tolerance in P. calomelanos, in order to improve its performance in the field. The harvesting of plants as soon as the appearing of visual symptoms, such as necrosis and shriveling of young fronds, can also improve the phytoremediation efficiency.Arsênio (As) é um metaloide amplamente distribuído no meio ambiente. A sua presença em água potável constitui um sério problema de saúde pública em diversos países devido aos seus efeitos mutagênicos e genotóxicos. A descontaminação de águas e solos requer o uso de tecnologias apropriadas de remediação de modo a prevenir ou reduzir os impactos no ecossistema. A utilização de monilófitas hiperacumuladoras de As possibilita o desenvolvimento de programas de fitorremediação menos onerosos e com melhor preservação ambiental. Pteris vittata L. foi a primeira hiperacumuladora descrita e tem sido amplamente estudada. Pityrogramma calomelanos L. (Link) por sua vez é uma hiperacumuladora menos conhecida, naturalmente encontrada em sítios contaminados com As. Esse trabalho teve como objetivo caracterizar as respostas morfoanatômicas e fisiológicas envolvidas no acúmulo e na tolerância ao As em P. calomelanos. Três experimentos foram conduzidos (E1, E2 e E3) utilizando esporófitos em diferentes estágios de desenvolvimento e expostos ao As (E1: 1 mM As; E2-E3: 1, 10, e 30 mM As) durante duas (E2) ou três (E1 and E3) semanas. As plantas foram cultivadas em solução nutritiva de Hoagland (1/2 F) e o As foi adicionado à solução na forma de arsenato de sódio. Plantas crescidas em solução sem adição de As foram usadas como controle. A fluorescência da clorofila a foi avaliada com auxílio de fluorômetro de imagem, Imaging-PAM (E2), ou fluorômetro portátil, Mini-PAM (E3; apenas parâmetros do escuro), e a concentração de clorofila foi estimada usando um medidor de clorofila portátil (SPAD) durante E1. Ao final dos experimentos, foram coletadas amostras para as análises fisiológicas (E1 e E3), microscópicas (E2), químicas (E1-E3) e de microfluorescência de raios-X com energia dispersiva (μ-EDXRF) (E1 e E3). Pityrogramma calomelanos apresentou elevado potencial de absorção, translocação e acúmulo de As. Concentrações de As nas frondes variaram de 3000 a 12000 mg kg-1 de massa seca (MS), sendo maiores para as plantas do E3. Em baixa dose de As (1 mM) as plantas acumularam As principalmente nas pinas (75 % arsenito), enquanto estipes e raízes apresentaram conteúdos de As próximas (74 e 95 % arsenato, respectivamente). Em E2, a partição de As foi semelhante a do E1, entretanto, em E3 estipes e raízes apresentaram concentrações de As tão altas quanto às pinas, em plantas expostas a 10 e 30 mM As. O As reduziu a concentração de P em plantas do E1, mas não alterou naquelas do E2 e E3. Em E1, As reduziu o conteúdo de K, Fe e Mg, bem como a translocação de K e S. A concentração de clorofila não foi alterada em plantas do E1 e E3, entretanto foram observadas diferenças na fluorescência da clorofila a em plantas expostas a 10 e 30 mM As (E2). Plantas apresentaram menor MS de pinas (E2: 30 mM As), e necroses marginais e apicais em frondes mais velhas (E2 e E3: 10 e 30 mM As). A análise anatômica destas plantas revelou o maior acúmulo de fenóis (áreas aparentemente sadias da pina) e colapso de tecidos principalmente na margem de pínulas e próximo às nervuras secundárias (áreas necróticas da pina). O As induziu alterações sutis em raízes (E2), como o escurecimento progressivo, despreendimento de células da coifa lateral aumento da espessura da parede celular e acúmulo de compostos granulares em células corticais de plantas tratadas com 30 mM As. A concentração de As na região apical e marginal das pinas, e ao redor de feixes vasculares, foi confirmada pelas análises de μ- EDXRF. Pityrogramma calomelanos apresentou um eficiente sistema de defesa antioxidante, demonstrado pelo aumento na atividade de enzimas antioxidantes (E1 e E3), de tióis não proteicos (E1), fenóis (E2 e E3), e outras moléculas antioxidantes (E3), especialmente na pina. Em doses elevadas, entretanto, os mecanismos de proteção se tornaram ineficientes ocasionando o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e da peroxidação lipídica na pina (E3), a qual também foi observada em raízes expostas a 1 mM As (E1). Em E3, a acumulação de As reduziu ou manteve a concentração de metabólitos associados ao metabolismo central de carbono (ex. glicose) e aumentou a de aminoácidos e proteínas totais. Aminoácidos envolvidos com o metabolismo de S, fotorrespiração, osmoproteção e síntese de compostos secundários foram os principais alvos do As. A análise conjunta dos resultados mostra que P. calomelanos pode ser usada com sucesso na remediação de sítios com contaminação moderada de As. Plantas com maior biomassa (ex. 5-7 fronds – E3) são preferíveis devido ao seu maior potencial de extração. Experimentos com exposição crônica são necessários para esclarecer os mecanismos dose-dependentes de tolerância ao As, aprimorando o desempenho de P. calomelanos em campo. A remoção da parte aérea das plantas tão logo apareça sintomas de toxidez (necroses e murcha) contribuirá para uma fitorremediação mais eficiente.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais