Ionized Hydrogen Peroxide (iHP) is a new technology used for the decontamination of surfaces or laboratory areas. It utilizes a low concentration of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) mixed with air and ionized through a cold plasma arc. This technology generates reactive oxygen species (ROS) as a means of decontamination. Although the technology has shown effectiveness in the inactivation of spores of biological indicators of Bacillus atrophaeus and Geobacillus stearothermophilus, its exact mechanism remains unknown. Therefore the purpose of this study was to determine the mechanism of inactivation utilized by iHP. The hypothesis of this research project was that the mechanism of sporicidal activity induced by ionized hydrogen peroxide was that it inactivates spores of B. atrophaeus and G. stearothermophilus by direct biochemical damage to the genomic DNA or by damage to essential germination factors that trigger the initiation of the spore germination and outgrowth process. To determine the exact mechanism, two pathways of inactivation were investigated. First, it was the visual verification with the use of a transmission electron microscope of the effects to the structure of the spores, and the second pathway was the verification of the impact by analyzing damages to the DNA of the spores by use of a SYBR green fluorescence- based quantitative polymerase chain reaction (qPCR). The uniform inactivation of B. atrophaeus and G. stearothermophilus and the reduction of the residual thermostable adenylate kinase (tAK) activity of enzyme indicators shows that iHP has a gas-like diffusion effect. Also direct biochemical damage to the genomic DNA was observed by the results of the visual and quantitative analysis. In conclusion, iHP inactivates spores by both physical damages of the spore structure and subsequent damage to the DNA. Keywords: Ionized Hydrogen Peroxide. DNA Damage. Inactivation of Spores. Bacillus atrophaeus. Geobacillus stearothermophilus.O peróxido de hidrogênio ionizado (iHP) é uma nova tecnologia usada para a descontaminação de superfícies ou áreas de laboratório. Trata-se de uma baixa concentração de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) misturada com o ar e ionizada através de um arco de plasma frio. Essa tecnologia gera espécies reativas de oxigênio (ERO) que atuarão em processos de descontaminação. Embora a tecnologia tenha demonstrado eficácia na inativação de esporos de indicadores biológicos como Bacillus atrophaeus e Geobacillus stearothermophilus, seu mecanismo exato permanece desconhecido. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar o mecanismo de inativação utilizado por iHP. A hipótese desse trabalho é que o mecanismo da atividade esporicida induzida por peróxido de hidrogênio ionizado em esporos de B. atrophaeus e G. stearothermophilus era induzido por lesões no DNA genômico ou em fatores germinativos essenciais na ativação da cascata de germinação de esporos e estes afetariam o processo de crescimento vegetativo. Para determinar o mecanismo exato, investigamos duas vias de inativação. Para responder a estes questionamentos, primeiro a verificação visual foi realizada com o uso de um microscópio eletrônico de transmissão para identificação os efeitos do iHP na estrutura dos esporos, e a segunda forma foi a verificação do impacto através da análise dos danos ao DNA dos esporos pelo uso de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) baseada em fluorescência verde SYBR. A inativação uniforme de B. atrophaeus e G. stearothermophilus e a redução da atividade residual da adenilato quinase termoestável (tAK) dos indicadores de enzimas mostram que o iHP tem um efeito de difusão semelhante a gás. Também observamos danos bioquímicos diretos no DNA genômico pelos resultados da análise visual e quantitativa. Em conclusão, o iHP inativa os esporos tanto pelos danos físicos da estrutura dos esporos quanto pelos danos subsequentes ao DNA. Palavras-chave: Peróxido de hidrogênio ionizado. Dano ao ADN. Inativação de esporos. Bacillus atrophaeus. Geobacillus stearothermophilus.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)