As rickettsioses constituem um grupo de doenças causadas por parasitas intracelulares obrigatórios da Ordem Rickettsiales. A febre maculosa brasileira (FMB) é a doença rickettsial mais prevalente no Brasil. Este trabalho teve como objetivo a detecção e caracterização molecular desses agentes para o conhecimento dos seus ciclos em ectoparasitos de animais domésticos e do ambiente em uma área endêmica para FMB no Estado do Espírito Santo. Foram coletados 502 ectoparasitos das espécies Amblyomma cajennense, Amblyomma cooperi, Riphicephalus sanguineus, Anocentor nitens e Ctenocephalides felis, de animais domésticos (cães e eqüinos) e do ambiente, os quais foram divididos em 152 lotes de acordo com a origem. Em lotes de todas as espécies de ectoparasitos citadas detectaram-se Rickettsia spp. em prevalências de 21,5%, 26%, 11,5%, 23,5% e 25%, respectivamente, pela amplificação de fragmentos do gene que codificam para a proteína 17kDa. Ehrlichia sp foi encontrada em 1,4% de lotes de R. sanguineus e em 4,0% de C. felis a partir de iniciadores gênero específicos para o gene do rRNA 16S. Fragmentos de 381pb do gene que codifica para a enzima citrato sintase foram amplificados de seis lotes, três dos quais foram negativos à amplificação por primers para o gene da proteína 17kDa. Rickettsia felis foi identificada em R. sanguineus e C. felis e Rickettsia prowazekii foi identificada em A. cooperi, C. felis e R. sanguineus. Com base nos resultados de comparação de seqüências do gene que codifica para a proteína 17kDa, dois fragmentos de R. felis amplificados neste estudo relacionaram-se mais proximamente com espécies de Rickettsia do grupo da febre maculosa, com seqüências nucleotídicas depositadas no GenBank, formando um sub-grupo com R. australis. Este é o primeiro relato no Brasil de Rickettsia prowazekii em carrapatos e pulgas e o primeiro achado de infecção de A. cooperi por este patógeno. Estudos mais detalhados são necessários para o entendimento da ecologia de Rickettsia e da epidemiologia de rickettsioses na área de estudo.The rickettsioses constitute a group of diseases caused by obligate intracellular parasites of the Order Rickettsiales. The Brazilian spotted fever (BSF) is the most prevalent rickettsial disease in Brazil. This work aimed the detection and molecular characterization of those agents to know their biological cycles in ticks and fleas of domestic animals and the environment in an endemic area for BSF in the State of Espírito Santo. Five hundred and two ectoparasites were collected, among Amblyomma cajennense, Amblyomma cooperi, Riphicephalus sanguineus, Anocentor nitens and Ctenocephalides felis from domestic animals (dogs and equines) and from the environment and they were divided in 152 lots according to the origin. Rickettsia spp were detected in lots of all the species of ectoparasites cited, in a prevalence 21.5%, 26%, 11.5%, 23.5% and 25%, respectively, by amplification of fragments of the 17kDa protein- encoding gene. Ehrlichia sp. was found in 1.4% of lots of R. sanguineus and in 4.0% of C. felis by amplification of 16S rRNA (rDNA) gene fragments. Fragments of 381 bp of the citrate synthase- encoding gene were amplified from six lots, three of them were negative to the amplification with primers for 17kDa-antigen gene. Rickettsia felis was identified in R. sanguineus and C. felis and Rickettsia prowazekii was identified in A. cooperi, C. felis and R. sanguineus. On the basis of the results 17 kDa-protein gene sequences comparisons, two R. felis fragments amplified in this study were closely related to species of Rickettsia of spotted fever group, with nucleotides sequences deposited in the GenBank, and they formed a cluster with R. australis. This is the first report in Brazil of R. prowazekii in ticks and fleas and the first discovery of infection of A. cooperi by this pathogen. More detailed studies are necessary to understanding the Rickettsia ecology and its epidemiology in the studied area.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior