Didelphis spp. are marsupials well adapted to anthropogenic activity, playing important role in the dissemination of pathogens to humans and domestic animals due to their circulation between the wild and the urban environment. Several parasite species, consisting of vectors of zoonotic pathogens (i.e. ticks and fleas), helminths and protozoa affect these marsupials. The aim of this study was to evaluate the parasitic fauna of D. aurita, and identify arthropod borne pathogens transmitted by ticks and fleas. From January to June 2019, 58 D. aurita were captured and ectoparasites, blood, spleen and fecal samples were collected for molecular and parasitological tests. DNA of ticks, blood and spleen samples was extracted and screened for Rickettsia, Borrelia, Babesia spp. and Anaplasmataceae by conventional Polymerase Chain Reaction (PCR). Blood and spleen DNA samples of 57 animals were further screened for Toxoplasma gondii by real time PCR (qPCR). Two tick species were identified, Ixodes loricatus in 41.38% (24/58) and Amblyomma sculptum in 1.72% (1/58) of the animals. For fleas, Ctenocephalides felis felis was detected in 60.34% (35/58) of the animals, and Xenopsyla cheopis in 5.17% (3/58). PCR analysis detected Anaplasmataceae DNA in 34.04% (n = 16/47) pool samples of C. felis felis, and in 66.66% (n = 2/3) pool samples of X. cheopis. Sequence analysis of the products revealed Wolbachia pipientis symbiont in all positive samples. Tick, blood and spleen samples scored negative for other pathogens assessed by conventional PCR. T. gondii DNA was detected in 26.32% (15/57) of the animals and BLAST analysis demonstrated 100% homology with sequences available in the GenBank database. Fecal samples were evaluated by parasitological procedures. Eggs and oocysts were analyzed at different magnifications (400x and 1000x), and their identification, together with adult nematodes, was established on morphological and morphometric features. Of all samples analyzed, 87.76% (n = 43/49) scored positive for at least one gastrointestinal parasite, being 83.67% (41/49) for helminths, and 65.30% (32/49) for protozoa. For Cryptosporidium, only 13 samples were evaluated due to insufficient amount of feces obtained of some animals. A frequency of 23.08% (3/13) was reported for this parasite. Samples positive for Eimeria spp. oocysts were allowed to sporulate in 2.5% potassium dichromate (K 2 Cr 2 O 7 ), and detailed morphometric analyses were performed to determine the species present. Opossums were infected with from one to five Eimeria spp. Four of the eimerians were discovered, described and named by others: E. auritanensis, E. caluromydis, E. gambai, and E. philanderi. Additionally, sporulated oocysts of a species new to science, herein named as Eimeria vicoensis n. sp., were detected. Data herein obtained demonstrated the parasitism in D. aurita by some species of ectoparasites, including those commonly found in domestic animals (C. felis felis and A. sculptum), and high infection rates by several helminths and protozoa species, including those with zoonotic potential. These findings imply that these opossums may be involved in zoonotic cycles of these parasites in urban environments; however, further studies are needed to elucidate the extent to which these animals are involved in the dissemination of these pathogens. Keywords: Didelphidae. Ticks. Fleas. Helminths. Protozoa.Didelphis spp. são marsupiais bem adaptados à atividade antrópica, apresentando importante papel na disseminação de patógenos para humanos e animais domésticos devido sua presença em ambientes selvagens e urbanos. Várias espécies de parasitos, incluindo artrópodes vetores de patógenos zoonóticos (ex. carrapatos e pulgas), helmintos e protozoários acometem estes marsupiais. O objetivo deste estudo foi avaliar a fauna parasitária em D. aurita, e identificar patógenos transmitidos por pulgas e carrapatos. De janeiro a junho de 2019, 58 D. aurita foram capturados e amostras de ectoparasitos, sangue, baço e fezes foram coletadas para testes moleculares e parasitológicos. DNA dos carrapatos, sangue e baços foram extraídos e testados para a presença de Rickettsia, Borrelia, Babesia spp. e Anaplasmataceae através de Reação em Cadeia de Polimerase convencional (PCR). Adicionalmente, amostras de sangue e baço de 57 animais foram testados para presença de Toxoplasma gondii através da PCR em tempo real (qPCR). Duas espécies de carrapatos foram identificadas como Ixodes loricatus em 41.38% (24/58) e Amblyomma sculptum em 1.72% (1/58) dos animais. Para pulgas, Ctenocephalides felis felis foi detectada em 60.34% (35/58) e Xenopsyla cheopis em 5.17% (3/58) dos animais. DNA de Anaplasmataceae foi detectado através da PCR em 34.04% (16/47) das amostras de C. felis felis e em 66.66% (2/3) das amostras de X. cheopis. A análise do sequenciamento dos produtos identificou Wolbachia pipientis em todas as amostras positivas. Amostras de carrapatos, sangue e baço foram negativas para todos os patógenos testados por PCR convencional. DNA de T. gondii foi detectado em 26.32% (15/57) dos animas e a análise do produto sequenciado demonstrou 100% de homologia com sequências disponíveis no banco de dados do GenBank. Amostras fecais foram avaliadas através de métodos parasitológicos. Ovos e oocistos foram analisados em diferentes objetivas (400x e 1000x), e a identificação dos mesmos e dos nematódeos adultos foi estabelecida através de características morfológicas e morfométricas. De todas as amostras analisadas, 87.76% (43/49) foram positivas para pelo menos um parasito gastrointestinal, sendo 83.67% (41/49) para helmintos e 65.30% (32/49) para protozoários. Para detecção de Cryptosporidium, apenas 13 amostras foram avaliadas devido a quantidade insuficiente de fezes coletadas em alguns animais. Foi observada uma frequência de 23.08% (3/13) para este parasito. Amostras positivas para oocistos de Eimeria spp. foram encubadas para esporular em dicromato de potássio (K 2 Cr 2 O 7 ) a 2.5% e análises morfométricas detalhadas foram realizadas para determinação das espécies presentes. Os animais apresentaram infecção consistindo de uma a cinco espécies de Eimeria. Quatro destas espécies foram descobertas, descritas e nomeadas em outros estudos: E. auritanensis, E. caluromydis, E. gambai, e E. philanderi. Adicionalmente, oocistos de uma nova espécie, nomeada como Eimeria vicoensis n. sp., foram detectados. Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram o parasitismo em D. aurita por algumas espécies de ectoparasitos, incluindo alguns comumente encontrados em animais domésticos (C. felis felis e A. sculptum), e uma alta taxa de infecção por várias espécies de helmintos e protozoários, incluindo aquelas com potencial zoonótico. Estes achados indicam que gambás podem estar envolvidos em ciclos zoonóticos destes parasitos em áreas urbanas; no entanto, mais estudos são necessários para elucidar o grau de envolvimento destes animais na disseminação destes patógenos. Palavras-chave: Didelphidae. Carrapatos. Pulgas. Helmintos. Protozoários.