Este trabalho teve por objetivo definir os parâmetros para a obtenção e regeneração de protoplastos de Crinipellis perniciosa. O melhor estabilizador osmótico para a liberação de protoplastos foi KCl 0.8M em tampão fosfato 10 mM, pH 5.8, contendo 20 mg.mL -1 da enzima lítica Glucanex e 10 mg.mL -1 de BSA, após 1 a 2 horas de digestão enzimática do micélio. Os protoplastos foram liberados nestas condições, na ordem de 2,0 x 10 7 por mL de estabilizador osmótico, a partir de 300mg de micélio secundário de C. perniciosa crescido em meio BDA. A melhor freqüência de regeneração obtida foi de 2,0% quando sacarose 0,5M foi utilizada como estabilizador osmótico. A coloração de núcleos dos protoplastos revelou que 58,8% dos protoplastos eram anucleados, 37,5% uninucleados e 3,7% binucleados. Uma análise genética por RAPD de C. perniciosa e das colônias regeneradas a partir de protoplastos não revelou polimorfismos entre elas, embora diferenças, como crescimento lento e aspecto morfológico do micélio de algumas colônias tenham sido observadas. O micélio do isolado de C. perniciosa, bem como das colônias regeneradas a partir de protoplastos, são dicarióticas e apresentam grampos de conexão.The conditions for the production and regeneration of protoplasts from the fungus Crinipellis perniciosa were studied. The highest release of protoplasts was obtained with 0.8 M KCl in phosphate buffer, pH 5.8, as an osmotic stabilizer; 20 mg.mL -1 of the lytic enzyme Glucanex; 10 mg.mL -1 of BSA and 1 to 2 hours of enzymatic digestion. Under these conditions, about 2.0 x 10 7 prtoplast.mL -1 were released from the secondary mycelium of C. perniciosa grown in BDA. The best regeneration frequency was achieved when 0.5M sucrose was used as an osmotic stabilizer. Nuclear Giensa staining revealed that 58,8% of the protoplasts were anucleate, 37,5% uninucleate, and 3,7% binucleate. Although differences in colony growth and mycelial aspect had been observed, RAPD analysis of colonies regenerate form protoplasts did not reveal any genetic polymorphism. The mycelium of C. perniciosa as well as those from colonies regenerate from protoplasts were dikaryotic and possessed clamp connections.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico