Foram objetivos do presente trabalho estimar a produção de proteína microbiana, utilizando-se a excreção total de derivados de purina (DP); comparar as excreções de DP e uréia obtidas a partir de coletas spot de urina com aquelas observadas em coletas de 24 horas; e avaliar as concentrações de N-uréia no plasma e no leite e as excreções de uréia. Utilizaram-se 16 vacas holandesas em quatro quadrados latinos balanceados 4 x 4, distribuídos de acordo com o período de lactação. Cada período experimental teve duração de 21 dias, sendo sete dias de adaptação e 14 dias para as coletas de amostras. As quatro rações experimentais, isoprotéicas, foram formuladas para conter na base da MS 60% de silagem de milho e 40% de concentrado. Foram utilizados níveis crescentes de uréia no concentrado: 0; 0,7; 1,4; e 2,1%, correspondentes aos níveis de proteína bruta na forma de compostos nitrogenados não-protéicos (NNP) das rações de 2,22; 4,18; 5,96; e 8,09%, respectivamente. O volume urinário foi estimado utilizando amostras de urina obtidas quatro horas após a alimentação (spot), dividindo-se a excreção diária média de creatinina pela concentração de creatinina na urina spot. O volume urinário e as excreções de DP e de uréia, estimados por meio da urina spot, não diferiram daqueles obtidos pela coleta de urina por 24 horas. As produções de N-microbiano estimadas e obtidas apresentaram valores máximos de 198,05 e 196,96 g/dia, nos níveis de compostos nitrogenados não-protéicos de 5,33 e 4,44%, respectivamente. A concentração de alantoína no leite decresceu linearmente com o aumento dos níveis de NNP na dieta e representou 4,5% da excreção total de DP. A excreção de creatinina não foi afetada pelos níveis de NNP na dieta (23,41 mg/kg PV), enquanto as excreções estimada e obtida de uréia, as concentrações de uréia e N-uréia no plasma e no leite aumentaram linearmente com os níveis de NNP na ração. Concentrações plasmáticas e no leite de N-uréia de 19 a 20 mg% e 24 a 25 mg%, respectivamente, representariam valores limites a partir dos quais ocorreriam perdas de compostos nitrogenados.The objectives of the present work were to estimate the microbial protein production using the total purine derivatives (PD) excretion, to compare the PD and the urea excretions, obtained from spot urine collection with that observed in the 24 hours collection and to evaluate the plasma and milk N-urea and urea urinary excretion. Sixteen Holstein lactating cows were assigned to four 4X4 Latin Square with 3-wk periods in accordance with the lactation period. The four experimental isoproteic diets were formulated to contain 60% of corn silage and 40% of corn meal, soybean meal, urea and mineral salt mixture as dry matter basis. Crescent levels of urea in the concentrate 0.0, 0.7, 1.4, and 2.1% corresponded to the crude protein of 2.22, 4.18, 5.96 and 8.09% of non protein nitrogen based compounds (NPN), respectively. The urine collection was also estimated with urine samples obtained four hours post fed (spot), by the relation of the daily mean creatinine excretion and the urine spot creatinine concentration. The urinary volume and PD excretion and urea estimated through the urine spot did not differ from that obtained from 24 h urine collection. The N-Microbial production estimated and obtained presenting maximum values of 198.05 and 196.96 g/day with the NPN levels of 5.33 and 4.44%, respectively. The milk allantoin concentration linearly decreased as the NPN increased in the diet and represented 4.5% of total PD excretion. The creatinine excretion was not influenced by the dietary NPN levels (23.41 mg/kg LW), while the estimated and obtained urea excretion, the plasma and milk urea and N-urea concentration linearly increased as the NPN increased in the diet. The plasma and milk N-urea concentration of 19-20 mg/dL and 24-25 mg/dL, respectively, represented the limit values from that would occur nitrogen compounds losses.