A técnica de Dried Blood Spot (DBS) utiliza de quantidades pequenas de amostra de sangue, que são aplicadas a um cartão celulósico, para sua análise. Nos últimos anos a sua utilização no controle de dopagem tem sido frequentemente estudada por iniciativa da Agência Mundial Antidopagem (WADA), cujas atribuições incluem a definição de quais substâncias são proibidas e harmonizar os parâmetros de detecção dos laboratórios por ela acreditados. Com a vigência de documento técnico (TD) publicado pela WADA que prevê o uso de DBS, criouse a necessidade do desenvolvimento de um método com tal abordagem no Laboratório Brasileiro de Controle de Dopagem (LBCD). Portanto, com o objetivo de incluí-lo no escopo de métodos acreditados do LBCD, foi desenvolvido um método na matriz DBS visando a detecção de glicocorticoides e dos estimulantes por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLAE-EM). Para isso foram avaliados parâmetros do procedimento de extração como: solução de extração, tempo de banho de ultrassom e influência do hematócrito. Além disso, foi também realizada a validação do método de acordo com critérios definidos pelo International Standard for Laboratories. Como resultado foi desenvolvido e validado um método eficiente para a detecção das substâncias estudadas, sem a influência de hematócrito e com média de rendimento de extração de 83%. O procedimento desenvolvido, e os resultados gerados pela aplicação deste, agrega informações sobre o comportamento de estimulantes e glicocorticoides na matriz DBS, corroborando para a geração de critérios na aplicação este tipo de análise no monitoramento de substâncias proibidas em competição.