Staphylococcus aureus é um patógeno de importância clínica e sua permanência em ambientes hospitalares está associada, entre outros fatores, à capacidade de adquirir resistência antimicrobiana e de formar biofilme. A linhagem CEB/ST239, prevalente em hospitais brasileiros, tem sido substituída, nos últimos anos, por outras linhagens, como USA100/ST5, também associada com multirresistência. O objetivo do estudo foi caracterizar a ação de antimicrobianos em células planctônicas e do biofilme previamente formado por amostras MRSA da linhagem USA100/ST5 isoladas de pacientes de hospitais do Rio de Janeiro entre 2004 e 2015. Um total de 63 amostras USA100/ST5 foram avaliadas, das quais 36 obtidas no período entre 2004 e 2009, e 27 no período de 2011 a 2015. A susceptibilidade a nove antimicrobianos de diferentes classes foi determinada para todas as amostras pelo método de disco-difusão, enquanto as concentrações mínimas inibitórias (CMIs) para daptomicina, linezolida, oxacilina e vancomicina foram avaliadas pela técnica de microdiluição em caldo. Uma amostra previamente classificada como produtora de biofilme forte foi selecionada para avaliação do efeito de sub-CMIs e CMIs de daptomicina, linezolida e vancomicina sobre o biofilme formado, e para determinação da concentração mínima de eliminação do biofilme (CMEB) para linezolida e vancomicina. Todas as amostras foram multirresistentes, apresentando resistência à ciprofloxacina, clindamicina, eritromicina e penicilina. O percentual de resistência à cloranfenicol, gentamicina e rifampicina se manteve baixo em ambos os períodos, sem diferença significativa entre eles. Não foi detectada resistência ao sulfametoxazol-trimetoprim e à tetraciclina. Apesar de todas as amostras serem MRSA, a CMI50 para oxacilina aumentou entre os períodos avaliados, de 128 µg/mL para >256 µg/mL. Para vancomicina, as CMI50 e CMI90 aumentaram de 0,5 µg/mL e 1 µg/mL para 2 µg/mL e 2 µg/mL, respectivamente. Além disso, todas as amostras isoladas entre 2004 e 2009 foram sensíveis à vancomicina, mas 11% das amostras isoladas entre 2011 e 2015 apresentaram resistência intermediária (VISA). Para daptomicia, além do aumento na CMI90 de 1 µg/mL para 2 µg/mL, também foi observado um aumento significativo (p = 0,0083) na não susceptibilidade, de 11% para 41%, entre os períodos. Houve aumento na CMI90 de 1 µg/mL para 2 µg/mL para linezolida, porém sem detecção de resistência. As sub-CMIs de daptomicina, linezolida e vancomicina não influenciaram no biofilme formado pela amostra clínica 1301a. Apenas a concentração de 2 X CMI de linezolida (2 µg/mL) foi capaz de reduzir significativamente o biofilme formado por essa amostra, e as CMEBs de linezolida e vancomicina foram >128 µg/mL. Podemos concluir que a multirresistência de amostras USA100/ST5, sua crescente resistência a antimicrobianos de importância clínica, assim como sua habilidade de produzir biofilmes fortes e resistentes à ação de fármacos podem ter contribuído para seu estabelecimento na clínica.