Biossensor é um instrumento analítico capaz de converter a concentração de um analito em um sinal, como o elétrico, através da integração de um elemento sensor biológico a um componente transdutor. Este trabalho apresenta a desenvolvimento de biossensor eletroquímico amperométrico composto por uma matriz do compósito grafite/polianilina (PANI), na qual são imobilizadas as enzimas horseradish peroxidase (HRP) e álcool oxidase (AOD) com o objetivo de detectar etanol e monitorar sua concentração em processos fermentativos. Para tal, testes foram feitos objetivando determinar qual era a melhor proporção dos componentes do compósito da matriz de imobilização. Medidas de condutividade e do ângulo de contato permitiram determinar a proporção de 30:70 de grafite:polianilina. Após essa etapa foi determinado o melhor agente aglutinante e diferentes métodos de imobilização das enzimas horseradish peroxidase e álcool oxidase foram propostos (adsorção de HRP, ligação covalente da HRP e adsorção de HRP e AOD) e seus desempenhos avaliados através de medidas voltamétricas. Com as principais características do eletrodo determinadas, foram feitos testes de voltametria cíclica com soluções de etanol de diferentes concentrações, com o objetivo de construir uma curva de calibração.