O controle de dopagem em cavalos de corrida tem importância fundamental nas competições esportivas a fim de obter resultados justos e eliminar animais irregulares, segundo normas definidas por federações equinas internacionais. Com esse intuito, métodos analíticos instrumentais são desenvolvidos para a identificação das substâncias proibidas nos fluidos biológicos dos cavalos, como o caso do clembuterol, molécula alvo desse trabalho. Para a realização do desenvolvimento e validação do método para a detecção de clembuterol, foram utilizadas amostras de urina e plasma de equinos, onde já tinha sido identificada a ausência de quaisquer substâncias proibidas. As amostras passaram por uma extração líquido-líquido, seguindo a metodologia já adotada no Laboratório de Análise de Resíduos (LAB RES), para obtenção dos padrões de clembuterol e padrão interno fortificados em matriz. Após essa etapa, as amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um espectrômetro de massas do tipo QTRAP (CLAE-EM/EM), onde foram realizados diversos testes para a validação do método, como: seletividade, limite de detecção, interferência da matriz, repetitividade, capacidade de identificação, rendimento de extração, arraste e robustez. O método foi validado com sucesso, obtendo um limite de detecção do clembuterol de 0,2 ng/mL em urina e 0,025 ng/mL em plasma. Um novo método de análise, utilizando a metodologia EM/EM/EM (EM3), foi sugerida para reduzir o limite de detecção do clembuterol somente na matriz de urina, que não alcançou os limites definidos pelas federações equinas internacionais de 0,1 ng/mL.