Resumo:Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório capaz de atravessar a barreira transplacentária e infectar o feto, causando a toxoplasmose congênita. Má formação muscular e neuronal, foi detectada experimentalmente pelo nosso grupo, durante o desenvolvimento de fetos murinos congenitamente infectados. Particularmente, o músculo esquelético mostrou atrofia e miosites. Os mecanismos pelos quais a infecção afeta o desenvolvimento do músculo esquelético ainda não foram esclarecidos. Este trabalho visa investigar os mecanismos moleculares que poderiam interferir no programa miogênico durante a infecção por T. gondii. Para este propósito, a linhagem murina C2C12 foi utilizada, devido a sua habilidade de diferenciação in vitro. Mioblastos plaqueados por 24 horas foram infectados com taquizoítos da cepa ME49 de T. gondii. Após 24 horas de infecção, o meio de proliferação foi substituído por meio de diferenciação. Em 24 ou 120 horas após a indução da diferenciação, as células foram processadas para Giemsa, imunofluorescência (avaliação de desmina, MyHC, MyoD, miogenina, SAG1, Ki67, caspase-3 clivada e \F062-catenina) ou qRTPCR (MyHC, MyoD, Myf5, miogenina e MRF4). Adicionalmente o meio condicionado foi coletado para análise do perfil de citocinas/quimiocinas utilizando Cytokine Bead Array (CBA) ou ELISA para TGF-\03B21. A atividade gelatinase das metalopeptidases de matriz (MMPs) foi determinada por zimografia. A infecção reduziu drasticamente as taxas de diferenciação e fusão, assim como o número e o diâmetro dos miotubos maduros. Os efeitos observados pela infecção por T. gondii foram: (i) redução da expressão da cadeia pesada de miosina, marcador de miogênese terminal, em 3,5 vezes; (ii) aumento na expressão de Myf5 e Mrf4 após 120 horas de indução; (iii) redução da expressão gênica e proteica de miogenina em ambos os tempos avaliados; (iv) aumento significativo de células em proliferação (positivas para Ki67) após 120 horas de indução; (v) expressivo aumento na secreção de IL-6 e MCP-1; (vi) diminuição da secreção de TGF-\03B2; (vii) aumento da secreção de MMP-3 após 24 horas e (viii) redução de imunomarcação nuclear de \F062-catenina após 10 horas de indução. T. gondii induziu severa resposta de células musculares esqueléticas à infecção com aumento na secreção de IL-6, MCP-1 e MMP-3 e redução da secreção de TGF-\03B2. A desregulada expressão dos MRFs possivelmente leva as células em cultura a permanecer num estado proliferativo, sem deflagração do programa miogênico.Paloma de Carvalho Vieira Toxoplasma gondii is an intracellular parasite capable of crossing the transplacental barrier and infecting fetal tissues, causing congenital toxoplasmosis. Previous studies of our group showed development defects in a murine model of congenital toxoplasmosis. The parasite has a strong tropism for the skeletal muscle cells, in which it forms tissue cysts. In experimentally infected pregnant mice, the skeletal muscle showed atrophy and myositis. The mechanisms by which the infection affects the development of the skeletal muscle has not been addressed until this moment. This work aims to investigate the molecular mechanisms that could interfere in the myogenic program during T. gondii infection. For this purpose, the mouse myoblast C2C12 cell line was utilized, due to its ability to differentiate in vitro. Myoblasts plated for 24 hours were infected with ME49 strain tachyzoites of T. gondii. 24 hours after infection proliferation medium was replaced for differentiation medium, as well documented in the literature. At 24 or 120 hours after induction, cells were processed to giemsa, immunofluorescence (evaluation of desmin, MyHC, MyoD, myogenin, SAG1, Ki67, cleaved caspase-3 and \F062-catenin) or qRT-PCR (MyHC, MyoD, Myf5, myogenin e MRF4). In addition, at the same points the conditioned medium was collected to for cytokines/chemokines analysis profiling using Cytokine Bead Array or ELISA for TGF-beta1. Gelatinase activity of Matrix metallopeptidases (MMPs) was determined by zymography. The infection can drastically reduce the differentiation and fusion indexes, as well as the number and the diameter of mature myotubes. The effects observed by T. gondii infection were: (i) reduction of myosin heavy chain expression, a marker of terminal myogenesis, in 3,5-fold; (ii) increased expression of Myf5 and Mrf4 after 120 hours of induction; (iii) decreased myogenin gene and protein expression in both evaluated times; (iv) a significant increase of proliferating cells (Ki67-positive) after 120 hours of induction; (v) expressive increased of IL-6 and MCP-1; (vi) decreased TGF-\03B2 secretion; (vii) increased MMP-3 secretion after 24 hours and (viii) decreased nuclear immunostaining of \F062-catenin in proliferating cells after 10 hours of induction. T. gondii induces a severe disarray of the skeletal muscle cell culture, with the increased secretion of IL-6, MCP-1 and MMP-3 and decreased secretion of TGFbeta. In short, the deregulation of the expression of MRFs possibly leads the culture to remain in a proliferative state and unresponsive to myogenic initiation.