A tuberculose (TB), provocada pelo Mycobacterium tuberculosis, é uma doença crônica contagiosa em aglomerados populacionais como as unidades prisionais. Neste trabalho realizou-se a identificação molecular de isolados de M. tuberculosis e investigação de infecção mista utilizando spoligotyping e MIRU-VNTR em 224 amostras de uma coorte do estado de Rondônia, populações geral e carcerária e análises de bioinformática em dois grupos distintos de genomas de micobactérias, sendo 30 genomas de Moçabique e 88 genomas da coleção do nosso laboratório. Amostras de escarro foram submetidas à baciloscopia, cultura para micobactérias, teste de sensibilidade aos antimicrobianos e identificação molecular pela técnica de Spoligotyping e MIRU-VNTR demonstraram a diversidade dos isolados de M. tuberculosis circulantes na região havendo a predominância de 63,8% da família LAM, seguido da família X com 11,6%, Haarlem 6,3% e família T com 4%, além de dois isolados da família Ural e cinco da família EAI Ainda, 18 novos perfis foram identificados, incluindo um perfil que há indícios de exclusividade do Brasil. Os resultados indicam que as cadeias de transmissão entre as populações geral e carcerária estão interligadas. As unidades prisionais apresentaram formação de grupos específicos de aglomerações e exclusividade das subfamílias T3 e X3. Entre a coorte de Rondônia, a taxa de resistência foi de 28% (4,8% MDR) e 46,6% entre os genomas analisados. Além disso, sugere-se que os isolados resistentes estão mais associados a população geral desse estudo e que processos evolutivos potencialmente associados ao surgimento de resistência. Foi detectada uma frequência de 19,3% de infecção mista pelo MIRU-VNTR e 80% por WGS; casos suscetíveis foram mais associados a infecção mista, exceto para casos MDR/XDR da coorte Brasil/Moçambique. Portanto, verifica-se a manutenção dos índices de TB em Rondônia, mas com uma diversidade maior do que o esperado, incluindo famílias com notificação em baixa frequência, bem como a indicação de que a presença da infecção mista pode ter importância clínica de acordo com a população.Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, is an infectious chronic disease in agglomerations such as prison units. In this work, the molecular identification of M. tuberculosis isolates and investigation of mixed infection using spoligotyping and MIRU-VNTR was carried out in 224 samples of a cohort in the state of Rondônia, general and prison populations and bioinformatics analyzes in two distinct groups of mycobacterial genomes, 30 genomes from Mozambique and 88 genomes from the collection of our laboratory. Samples were analyzed with sputum smear microscopy, mycobacterial culture, antimicrobial susceptibility test and molecular identification using the Spoligotyping and MIRU-VNTR technique which revealed the diversity of M. tuberculosis isolates present in the region, with a predominance of 63.8% of the family LAM, followed by family X with 11.6%, Haarlem 6.3% and family T with 4%, in addition to two isolates from the Ural family and five isolates from the EAI family In addition, 18 new profiles were identified, including a profile that shows signs of being exclusive to Brazil. The results indicate that the transmission chains between the general and prison populations are interconnected. The prison units showed specific groups of agglomerations, and subfamilies T3 and X3 were exclusive to this population. In the Rondônia cohort, the resistance rate was 28% (4.8% MDR) and 46.6% among the analyzed genomes. In addition, the results suggest that resistant isolates are more associated with the general population of this study and that evolutionary processes potentially associated with the emergence of resistance. We detected a frequency of 19.3% of mixed infection by MIRU-VNTR and 80% by WGS; susceptible cases were more associated with mixed infection, except for MDR/XDR cases from the Brazil/Mozambique cohort. Therefore, the TB rates in Rondônia persist, with a greater than expected diversity, including families with low frequency notification. The suggestion of mixed infection may have clinical importance according to the population.