No Brasil, a Mansonelose é uma doença filarial crônica que atinge milhares de pessoas residentes de zonas rurais na Amazônia. Até recentemente, não havia nenhum tratamento clínico prático ou opções de controle para esta doença. No entanto, novas terapias curativas com custo-benefício viável voltadas para o uso de Wolbachia sp. no tratamento para a Mansonelose estão atualmente sendo estudadas em países da África. Essas novas opções de tratamento têm o potencial de mudar radicalmente a viabilidade para o controle efetivo da Mansonelose, portanto, existe uma necessidade urgente para compreender a epidemiologia dessa doença na Amazônia. No norte do estado do Amazonas, Simulium oyapockense é um inseto hematófago conhecido por ser vetor de Mansonela ozzardi (o mais importante agente causador de Mansonelose na região) e Onchocerca volvulus (o único agente causador da oncocercose). Após o isolamento acidental de uma nova cepa de Wolbachia sp. a partir de um pool de extratos de DNA de S. oyapockense infectados com M. ozzardi, este estudo usou um novo método de triagem de Tipagem de Sequência de Múltiplos Locus (MLST) utilizando baixa temperatura de anelamento (LAT) para classificar esta nova cepa de Wolbachia sp. e desenvolver um novo método para diagnosticá-la com menor custo e tempo. Após o teste de 17 ensaios LAT PCR em uma amostra de DNAestoque de S. oyapockense (composto de amostras de DNA de 96 espécimes), cinco desses ensaios (projetados para amplificar as sequências dos genes coxA, dnaAa, ftsZ, fabK e wD 0183) foram selecionados para o diagnóstico de Wolbachia sp. utilizando a abordagem MLST. Dos 96 extratos de S. oyapockense testados com esta metodologia, 90 foram positivos para os cinco genes-alvo, dois foram positivos em 1-4 e quatro foram negativos para todos os 5 PCRs LAT MLST, mas positivos para o CO1 (usado separadamente para controle de amplificação). A análise das sequências gênicas referentes a coxA, dNAa, ftsZ, fabK e wd 0183 obtidos a partir de cinco extratos de DNA de S. oyapockense não forneceu evidências de variação gênica entre as sequências dos cinco espécimes testados, independentemente dos alvos usados para o ensaio. A classificação filogenética baseada na abordagem MLST, bem como a análise filogenética realizada usando individualmente cada um dos genes classificou consistentemente a Wolbachia sp. identificada como pertencentes ao “Super grupo B”. Os resultados coletados para este estudo sugerem fortemente que mais de 90% dos espécimes de S. oyapockense coletados em atividades de hematofagia em São Gabriel da Cachoeira estão infectados com uma única cepa de Wolbachia do Super grupo B, denominada como “wSoya”. Futuros estudos serão necessários para determinar se a presença desta bactéria nesse vetor influencia a dinâmica de transmissão da mansonelose ou oncocercose na região.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESMansonellosis is a chronic filarial disease that affects many thousands of residents living in the rural regions of the Brazilian Amazon. Until recently there have been no practical clinical treatments or control options for this disease. Novel cost-effective curative Wolbachia-targeting therapeutics with the potential to treat mansonellosis are, however, presently in clinical trials in Africa. These novel treatment options have the potential to radically change the feasibility of effective mansonellosis control and thus there is a fresh and urgent need to improve our understanding of mansonellosis epidemiology in the Amazon region. In the North of the Amazonas state region, S. oyapockense is a hematofage insect known to be a vector of both M. ozzardi (the most important causative agent of mansonellosis in the region) and O. volvulus (the only causative agent of onchocerciasis). Following the serendipitous isolation of a novel Wolbachia sp. sequence from a pool of M. ozzardi infected S. oyapockense DNA extracts, this study used a novel low-annealing temperature (LAT) Multi Locus Sequence Typing (MLST) screening method to rapidly classify this new strain and develop a new method for diagnosing it. After testing 17 different Wolbachia-detecting LAT PCR assays on a S. oyapockense DNA stock sample (composed of DNA from 96 simuliids), 5 of these assays (designed to amplify CoxA, DNAa, FtsZ, FabK and WD 0183 gene sequences) were selected for a MLST-based Wolbachia sp. diagnosing assay. Of the 96 S. oyapockense individual DNA extracts tested with this new methodology, 90 tested positive with all 5 MLST PCRs, 2 tested positive with 1-4 PCRs, and 4 tested negative for all 5 target-genes, but positive for DNA CO1 amplifiable (using as amplifying control). Sanger sequencing of five CoxA, DNAa, FtsZ, FabK and WD 0183 gene sequences obtained from 5 Wolbachia positive S. oyapockense DNA extracts, provided no evidence of within gene sequence variation among the five tested S. oyapockense for any of the five target genes used for the MLST assay. MLST phylogenetic classification of a concatemed of the five gene sequences and phylogenetic analysis performed using each of the 5 gene sequences individually, consistently classified the Wolbachia sequences recovered for this study as belong to a Super group B. The results collected for this study strongly suggest that over 90% of anthropophilic S. oyapockense from Sao Gabriel da Cachoeira are infected with a single strain of Super group B Wolbachia, named as “wSoya”. Future studies will be needed to determine if the presence of this strain influences the region´s mansonellosis or onchocerciasis disease transmission dynamics.