O genótipo Sudeste Asiático do vírus dengue sorotipo 2 (DENV-2) circula no Brasil desde a década de 1990. No entanto, estudos filogenéticos revelaram a circulação de duas linhagens distintas deste genótipo no país e análises moleculares revelaram alterações nucleotídicas conservadas no domínio II do gene do envelope viral específicas de cada linhagem. Em 2008, a linhagem II do DENV-2 foi responsável pela epidemia mais grave de dengue no Brasil, com aumento significativo na frequência de formas graves, afetando principalmente indivíduos com até 15 anos de idade. Neste cenário, a caracterização das variantes genéticas dos vírus circulantes em surtos e epidemias é de grande relevância para o conhecimento do potencial impacto na população. Rotineiramente, a ferramenta padrão utilizada para estudos de caracterização e vigilância genotípica dos DENV é baseado no sequenciamento genômico pelo método de Sanger. Apesar desta metodologia ser vantajosa ao fornecer dados do genoma viral, as desvantagens incluem o alto custo e a maior demanda de tempo necessário para tal caracterização. Desta forma, neste estudo visamos padronizar uma reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real associado à análise da curva de dissociação de alta resolução (High Resolution Melting-HRM) como uma ferramenta de tipagem de linhagens. Para tal, foram desenhados primers específicos aos polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) E129 e E131, capazes de distinguir tais linhagens. Para o estabelecimento das condições ótimas para o protocolo de PCR-HRM, foram determinadas as temperaturas de melting específicas para linhagem I e II do genótipo Asiático/Americano do DENV-2 e avaliada a especificidade dos primers sintetizados frente a outros arbovírus de importância médica. Os primers sintetizados se mostraram específicos e capazes de diferenciar cada linhagem, em uma reação de duas horas, incluindo amplificação e análise de curva de dissociação. Por se tratar de uma metodologia mais rápida, altamente específica, sensível e com custo mais baixo que o sequenciamento, esta ferramenta visa o fortalecimento dos sistemas de vigilância virológica dos laboratórios de diagnóstico de arbovírus no país, contribuindo para o monitoramento da emergência e reemergência de linhagens do DENV-2 com potencial patogênico para causar epidemias mais graves.The Southeast Asian genotype of dengue virus serotype 2 (DENV-2) has been circulating in Brazil since the 1990s. However, phylogenetic studies revealed the circulation of two distinct strains of this genotype in the country and molecular analysis revealed nucleotide changes conserved in domain II of the viral envelope gene-specific to each strain. In 2008, DENV-2 strain II was responsible for the most serious dengue epidemic in Brazil, with a significant increase in the frequency of severe forms, mainly affecting individuals up to 15 years of age. In this scenario, the characterization of the genetic variants of viruses circulating in outbreaks and epidemics is of great relevance for the knowledge of the potential impact on the population. Routinely, the standard tool used for studies of characterization and genotypic surveillance of DENV is based on genomic sequencing by the Sanger method. Although this methodology is advantageous in providing data from the viral genome, the disadvantages include the high cost and the increased demand of time required for such characterization. Thus, in this study, we aim to standardize a polymerase chain reaction (PCR) in real-time associated with the analysis of the high-resolution dissociation curve (High-Resolution Melting-HRM) as a strain typing tool. For this purpose, primers specific to single nucleotide polymorphisms (SNP) E129 and E131 were designed, capable of distinguishing such strains. To establish the optimum conditions for the PCR-HRM protocol, the melting temperatures specific for lineage I and II of the Asian / American genotype of DENV-2 were determined and the specificity of the primers synthesized compared to other arboviruses of medical importance was evaluated. The synthesized primers proved to be specific and capable of differentiating each strain, in a two-hour reaction, including amplification and dissociation curve analysis. As it is a faster, highly specific, sensitive methodology and with a lower cost than sequencing, this tool aims to strengthen the virological surveillance systems of arbovirus diagnostic laboratories in the country, contributing to the monitoring of the emergence and reemergence of strains of DENV-2 with pathogenic potential to cause more serious epidemics.2121-06-09