O Trypanosoma cruzi (Classe Kinetoplastea) é o agente etiológico da doença de Chagas, uma doença endêmica de populações rurais que possui uma história de negligência à sua prevenção, diagnóstico e tratamento. A partir do sequenciamento de seu genoma, em 2005, a maioria dos cerca de nove mil genes codificadores de proteínas foi classificada como de função desconhecida/putativa. Dentre estes nove mil genes, há a família das miosinas que, embora sejam conhecidas, tem um alto nível de divergência quando comparada com as miosinas dos demais eucariotos, apresentando domínios até então não associados a esta família. Miosinas são proteínas motoras dependentes de actina, com uma variedade de funções e têm sido usadas para reconstruir a árvore da vida eucariótica, sendo que a inclusão de ramos basais (de origem precoce), como os Kinetoplastea, é fundamental para entender a origem e evolução dos genes dessa família. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo fazer a reconstrução filogenética da família das miosinas em Kinetoplastea, além de realizar a caracterização funcional de genes de miosinas de T. cruzi por meio de nocaute gênico, avaliação do crescimento e diferenciação, infecção de células Vero, análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão e varredura, isolamento de microvesículas (exocitose) e ensaios de endocitose. Os nocautes obtidos para TcMyoA e TcMyoD apresentaram diminuição da metaciclogênese, posição/morfologia dos reservossomos alterada, além de diminuição do conteúdo de transferrina endocitada. A reconstrução filogenética das miosinas em Kinetoplastea revelou ainda que T. cruzi manteve grande parte das miosinas ancestrais, assim como Bodo saltans e alguns tripanossomatídeos. Apesar disto, grande parte da variedade de miosinas encontrada neste grupo foi perdida pela maioria dos tripanossomatídeos, embora interessantes eventos de neofuncionalização tenham ocorrido no decorrer da evolução dessas espécies. Assim, nós apresentamos aqui uma bela história evolutiva da família das miosinas em tripanossomatídeos e a caracterização funcional de alguns desses genes mostrou sua importância em processos celulares como endocitose e metaciclogênese.Trypanosoma cruzi (Class Kinetoplastida) is the etiologic agent of Chagas' disease, an endemic disease of rural populations that have a history of negligence in its prevention, diagnosis, and treatment. With the sequencing of the parasite genome in 2005, most of the approximately 9,000 protein-encoding genes were classified as of unknown/putative function. However, the myosin family could be fully annotated despite their high level of divergence from other eukaryotes. Myosins are actin-dependent motor proteins with a variety of functions and have been used to reconstruct the tree of eukaryotic life. The inclusion of basal branches (of early origin), such as Kinetoplastida, is fundamental to understand the origin and evolution of myosin genes. Therefore, we aimed to reconstruct the phylogeny of the myosin family in Kinetoplastida. Also, we performed the functional characterization of some of the T. cruzi myosin genes by gene knockout, by analyzing the growth and differentiation, the infection of Vero cells, analyzed the morphology by transmission and scanning electron microscopy, and performed exocytosis (microvesicle isolation) and endocytosis assays. The knockouts obtained for TcMyoA and TcMyoD presented a decrease in metacyclogenesis and endocytosis, and an alteration in position/morphology of the reservosomes. The phylogenetic reconstruction of the myosin family found in Kinetoplastida revealed that T. cruzi retained a great part of the ancestral myosins, as well as Bodo saltans and some trypanosomatids. Despite this, a great number of these genes was lost by most trypanosomatids, although interesting events of neofunctionalization had occurred during the evolution of these species. Thus, we present here an amazing evolutionary history of the myosin family in trypanosomatids and the functional characterization of some of these genes showed its importance in cellular processes such as endocytosis and metacyclogenesis.