Leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma antropozoonose causada por diferentes espécies de protozoário do gênero Leishmania, que causam lesões na pele e/ou mucosas de vias aerodigestivas superiores de humanos e outros mamíferos. O diagnóstico definitivo de LTA é baseado em exames laboratoriais que detectam o parasito na lesão, o que muitas vezes é difícil pela baixa carga parasitária. Nesse contexto, a técnica de hibridização in situ (HIS) tem se mostrado promissora, detectando espécies de Leishmania em tecidos. Este estudo objetiva comparar as técnicas de hibridização in situ usando sonda genérica, histopatologia e imuno-histoquímica para diagnóstico de leishmaniose tegumentar americana humana em amostras de pele. Foram selecionadas 50 amostras de biopsia de pele obtidas de pacientes atendidos no Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI), Fiocruz, no período de 2000 a 2005, nos quais foi possível o diagnóstico de LTA por isolamento em cultura e caracterização de Leishmania braziliensis As amostras foram fixadas em formol, incluídas em parafina e examinadas pelas técnicas de HIS usando sonda genérica para Leishmania, imuno-histoquímica (IHQ) e histopatologia, para avaliação da sensibilidade dos três métodos, utilizando a cultura parasitológica como padrão ouro. Para avaliação de reações cruzadas pelas técnicas de HIS e IHQ, foram também incluídas amostras adicionais de três pacientes com diagnóstico de micoses cutâneas causadas por Sporothrix spp., Candida albicans e Histoplasma capsulatum. As sensibilidades das técnicas de IHQ, HIS e histopatologia na detecção de formas amastigotas foram de 66%, 54% e 50%, respectivamente. A técnica de HIS não apresentou hibridização cruzada com antígenos fungícos, enquanto a IHQ apresentou reação cruzada com todas as espécies de fungos aqui estudadas. A técnica de HIS apresentou boa sensibilidade na detecção de formas amastigotas e ausência de reação cruzada com espécies de fungo, de modo que o seu emprego é recomendado na rotina diagnóstica do Serviço de Anatomia Patológica do INI, Fiocruz.American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an anthropozoonosis caused by different protozoan species belonging to the Leishmania genus, and causes lesions on the skin and/or mucosa of the upper airways of humans and other mammals. A definitive ATL diagnosis is based on laboratory tests that detect the parasite in the lesions, which is often difficult due to low parasite loads. In this context, the in situ hybridization (ISH) technique was shown to be promising, by satisfactorily detecting Leishmania species in tissues. The aim of this study was to compare the techniques of in situ hybridization using a generic probe, histopathology and immunohistochemistry to diagnose American tegumentary leishmaniasis in skin samples. The sample comprised fifty skin biopsy specimens from patients seen at the Evandro Chagas National Institute of Infectious Diseases (INI), Fiocruz, between 2000 and 2005, in which LTA diagnosis was confirmed through parasite isolation in culture followed by characterization of Leishmania braziliensis The specimens were fixed in formalin, embedded in paraffin and analysed through ISH, using a generic probe for Leishmania, immunohistochemistry (IHC) and histopathology, for evaluating the sensitivities of the three different methods, using parasite culture as a reference standard. Additional specimens from three patients diagnosed with cutaneous mycoses caused by Sporothrix spp., Candida albicans e Histoplasma capsulatum were also included to evaluate cross-reactions in ISH and IHC. The sensitivities of IHC, ISH and histopathology for detecting amastigotes of Leishmania were 66%, 54% and 50%, respectively. The ISH technique did not show cross-hybridization with fungal antigens, while IHC presented cross-reactions with all the fungal species herein evaluated. The ISH technique showed good sensitivity in the detection of amastigote forms and the lack of cross-reactions with fungal species, so that its use is recommended in the diagnostic routine at the Anatomical Pathology Service at INI, Fiocruz.