Leishmania tarentolae é uma espécie de Leishmania isolada de répteis e não patogênica ao homem. Esta espécie é amplamente utilizada como modelo de expressão de proteínas em eucariotos. Em função da rápida proliferação em cultura e a facilidade de manejo laboratorial, L. tarentolae tem sido empregada como modelo de estudos bioquímicos, moleculares e ultraestruturais. Em 2012, o genoma completo de uma cepa de L. tarentolae foi sequenciado, e dentre diversos dados reportados, destacamos a expansão gênica de um importante fator de virulência, a GP63. A expansão gênica foi correlacionada com a ausência de atividade proteolítica desta peptidase, que não fora detectada nas condições ensaiadas. A GP63 é uma glicoproteína com atividade de metalopeptidase, dependente de zinco, com altos níveis de expressão nas formas promastigotas do gênero Leishmania, e com homólogos ativos em diversos tripanossomatídeos monoxênicos e espécies do gênero Trypanosoma. A GP63 pode ser encontrada na superfície celular, ligada a uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI), podendo ainda ser encontrada na sua forma solúvel dentro de vesículas, onde também está ancorada à membrana das vesículas, ou secretada. Este trabalho está centrado na hipótese que existe uma GP63 proteoliticamente ativa em L. tarentolae. Nesse sentido, através da técnica de zimografia (SDS-PAGE-caseína) e ensaios fluorimétricos com Gelatina-FITC, demonstramos a presença de uma proteína que migra na faixa de 60 kDa, que apresenta atividade proteolítica e é inibida por 1,10-fenantrolina e EDTA. Através de Western blotting, detectamos uma proteína migrando nesta faixa de massa molecular que apresentou reação cruzada com o anticorpo anti-gp63 de Leishmania mexicana Os níveis de GP63 foram avaliados por citometria de fluxo e Western blotting, e curiosamente, não houve variação significativa em relação a Leishmania braziliensis. Por fim, analisamos o genoma de L. tarentolae, e selecionamos um gene para clonagem e super-expressão (+GP63Lta), bem como um gene de GP63 de Leishmania major (+GP63Lmj), que foi selecionado por ter a estrutura tridimensional resolvida por cristalografia, e estar bioquimicamente bem caracterizada. Os mutantes foram comparados quanto ao perfil proteolítico e localização celular da GP63. O mutante +GP63Lta apresentou um discreto aumento na atividade proteolítica em relação a cepa selvagem, enquanto que +GP63Lmj apresentou um halo de degradação intenso, comparável a espécies patogênicas de Leishmania. Não detectamos diferenças significativas no perfil de distribuição celular entre cepas selvagem e mutante. Nossos próximos passos incluem a análise do comportamento biológico entre essas cepas, como perfil de crescimento em cultura, infecção in vitro de macrófagos e células de inseto e infecção in vivo de flebotomíneos e camundongos, além da purificação da GP63 de L. tarentolae para caracterização bioquímica detalhada. Estes dados contribuirão para o conhecimento acerca das funções biológicas da GP63 na família Trypanosomatidae.Leishmania tarentolae is a species of Leishamnia isolated from reptiles and non-pathogenic to humans. This species has been widely employed as a platform foe eukaryotic protein heterologous expression system. In addition, due to its fast proliferation in culture and the ease laboratory management, L. tarentolae had been used as model for biochemical, molecular and ultrastructural studies in trypanosomatids. In 2012, the complete genome of a L. tarentolae strain was sequenced, among the data analyzed, we would like to highlight the gene expansion of an important virulence factor - GP63. The gene expansion was correlated with the absence of proteolytic activity of this peptidase, which was not detected under the assayed conditions. GP63 is a glycoprotein with a zinc-dependent metallopeptidase activity, with high expression levels in the promastigote forms of the genus Leishmania, and with active homologues in several monoxenic trypanosomatid and in Trypanosoma spp. GP63 can be either attached to a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor in membranes or as hydrophilic isoforms within vesicles, isoforms are also secreted. This work was conceived based on the hypothesis that GP63 is proteolytically active in L. tarentolae. In this sense, by the zymography technique (SDS-PAGE-casein) and fluorimetric assays with Gelatin-FITC, we demonstrated the presence of a protein that migrates in the 60 kDa range, which showed proteolytic activity and that was inhibited by 1,10-phenanthroline and EDTA. By Western blotting, we detected a protein migrating in same the molecular range that cross reacted anti-gp63 from Leishmania mexicana GP63 levels were assessed by flow cytometry and Western blotting, and interestingly, there was no significant difference in protein levels when compared to Leishmania braziliensis. Finally, we analyzed the genome of L. tarentolae, and selected a gene for cloning and superexpression (+ GP63Lta), as well as a Leishmania major GP63 gene (+ GP63Lmj), which was selected because it has the three-dimensional structure resolved by crystallography and because it is biochemically well characterized. The generated mutants were compared for the proteolytic and GP63 cellular imunolocalization. The mutant +GP63Lta showed a slight increase in proteolytic activity in comparison to the wild strain, whereas +GP63Lmj presented an intense halo of degradation, comparable to pathogenic species of Leishmania. We did not detect differences in the cell distribution profile between wild and mutant strains. Our next steps include an analysis of the biological behavior among strains, such as growth profile in culture, in vitro infection of macrophages and insect cells and in vivo infection of sandflies and mice, in addition to the purification of GP63 from L. tarentolae for detailed biochemical characterization. These data will contribute to the knowledge of the biological functions of GP63 in the family Trypanosomatidae.2500-12-31