Thesis
Estudo da associação de marcadores para Trypanosoma cruzi e humanos em uma coorte de pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas crônica
Registro en:
LIMA, Ana Carolina Bastos de. Estudo da associação de marcadores para Trypanosoma cruzi e humanos em uma coorte de pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas crônica. 2021. 192 f. Tese (doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2021.
Autor
Lima, Ana Carolina Bastos de
Resumen
A doença de Chagas (DC) é caracterizada por amplo espectro de desfechos clínicos, variando em severidade desde infecções assintomáticas até as formas graves relacionadas a danos cardíacos e no trato digestivo. No tocante ao Trypanosoma cruzi, seu agente etiológico, a heterogeneidade intraespecífica tem sido largamente investigada, e a correlação dos diferentes genótipos com as manifestações clínicas da doença ainda é desafiadora. O perfil genético do hospedeiro e a resposta imune frente à infecção são considerados fatores potencialmente importantes na progressão da doença. Este trabalho pretende analisar parâmetros relacionados ao T. cruzi (carga parasitária e genótipo) e humanos (polimorfismos de base única - SNPs em genes de citocinas e quimiocinas), buscando correlacioná-los com as diferentes formas clínicas da DC, sexo e idade dos pacientes. Dos 294 pacientes atendidos no Instituto Nacional de Infectologia, Fiocruz, 130 (44,2%) apresentaram PCR em tempo real (qPCR) positiva: 32 (24,6%) apresentavam a forma indeterminada, 74 (56,9%) a forma cardíaca (34 no estágio A, 23 nos estágios B1+B2, 17 nos estágios C+D), 18 (13,8%) com a forma mista e 6 (4,6%) portadores da forma digestiva. A carga parasitária no sangue dos pacientes variou de 0,002 a 72,21 eq. parasitos/mL, com valor da mediana de 0,390 [0,0700 – 2,050] eq. parasitos/mL. Todos os pacientes positivos por qPCR tiveram a identificação dos genótipos de T. cruzi diretamente do sangue. Os genótipos TcII e TcVI foram os mais prevalentes, representando 39,2% e 38,5%, respectivamente. Ademais, foi observado infecção única por TcIV em um paciente (de Pernambuco) com cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) no estágio A. Infecção única por TcV foi identificada em um paciente oriundo da Bahia apresentando CCC no estágio C; e casos de coinfecção TcII+TcV em um paciente (da Paraíba), com a forma indeterminada, e TcII/TcVI+TcV em outro paciente (de Minas Gerais), também na forma indeterminada. Quando foram comparados genótipos do parasito e carga parasitária, observaram-se medianas de 0,785 e 0,230 eq. parasitos/mL para TcII e TcVI, respectivamente. As frequências de CCC entre os pacientes infectados foram de 43,2% e 35,1%, relacionadas aos genótipos TcII e TcVI, respectivamente. Em relação à genotipagem dos SNPs posicionados nas regiões promotoras de genes de citocinas, desenvolvemos ensaios baseados em qPCR com High Resolution Melting, para a padronização e validação dos testes para 15 SNPs em 12 genes de citocinas, sendo estes: TNFA (-238G/A rs361525, - 308G/A rs1800629 e -1031T/C rs1799964), IL18 (-1297T/C, rs360719 e rs2043055A/G/T), IL1B (-511A/G rs16944), IL1RN (+11100T/C/A rs315952), IL12B (+1188A/C rs3212227), IL10 (-1082G/A rs1800896), IL4 (-509C/T rs2243250), MIF (- 173G/C, rs755622), IFNG (+874T/A rs2430561), IL17A (SNP G197A/G, rs2275913), IL17F (T7488C/T, rs763780) e TGFβ1 (códon 10 ou +869T/C/G rs1800470). Dois alvos foram eleitos (TNFA SNP -308G/A, rs1800629 e IL10 SNP -1082G/A, rs1800896) para a identificação destes SNPs na população de estudo. Não foram encontradas evidências de associação destes polimorfismos com a suscetibilidade ao desenvolvimento da DC. Porém, um valor de Qui-Quadrado muito próximo do nível de significância (Borderline 5%), X2= 3,742 e p=0,053, foi observado, sugerindo uma tendência de associação do alelo A de TNFA ao risco de DC. Em conjunto, tais achados reforçam o conceito de que a interação entre parasito/hospedeiro é essencial para o desenvolvimento da DC, bem como para a sua epidemiologia Chagas Disease (CD) is characterized by a broad spectrum of clinical outcomes, varying in severity from asymptomatic infection to severe forms related to cardiac and digestive tract damages. Regarding the parasite Trypanosoma cruzi, the etiological agent of the disease, its intraspecific heterogeneity has been widely investigated and the correlation of the different genotypes with clinical manifestations of the disease is still a great challenge. The host's genetic profile and the immune response to infection are considered important factors in the progression of the disease. The present work aims to analyze parameters related to T. cruzi (parasite load and genotype) and humans (single base polymorphisms – SNPs in cytokines and chemokines genes), searching to correlate them with the different clinical forms of CD, sex and age of the patients. Of the 294 patients assisted in the Instituto Nacional de Infectologia, Fiocruz, 130 (44.2%) had positive qPCR results, of which, 32 (24.6%) presented the indeterminate form of CD, 74 (56.9%) the cardiac form (34 in stage A, 23 in stages B1+B2, 17 in stages C+D), 18 (13.8%) with mixed clinical form and 6 (4.6%) with the digestive form. The parasitic load in blood of the patients ranged from 0.002 to 72.21 eq. parasites/mL, with median value of 0.390 [0.0700 - 2.050] eq. parasites/mL. In all positive patients by qPCR, it was possible to identify T. cruzi genotypes directly from blood. The genotypes TcII and TcVI were the most prevalent, representing 39.2% and 38.5%, respectively. In addition, a single infection by TcIV was observed in one patient (from Pernambuco) with chagasic cardiomyopathy (CCC) in stage A. A single infection by TcV was identified in one patient (born in Bahia) presenting CCC in stage C. Beyond, co-infection cases byTcII+TcV in one patient (born in Paraíba) with the asymptomatic form, and TcII/TcVI+TcV in other patient, also with the asymptomatic form, from Minas Gerais. When comparing the parasite genotypes and parasite load, it was observed a median of 0.785 and 0.230 eq. parasites/mL for TcII and TcVI genotypes, respectively. Among the infected patients, the frequencies of CCC were 43.2% and 35.1% related to TcII and TcVI genotypes, respectively. Regarding the genotyping of SNPs positioned in the promotor regions of cytokine genes, we developed real-time PCR-based assays with High Resolution Melting for the standardization and validation of the tests for 15 SNPs in 12 human cytokine genes, being these: TNFA (- 238G/A rs361525, -308G/A rs1800629 and -1031T/C rs1799964), IL18 (-1297T/C, rs360719 and rs2043055A/G/T), IL1B (-511A/G rs16944), IL1RN (+11100T/C/A rs315952), IL12B (+1188A/C rs3212227), IL10 (-1082G/A rs1800896), IL4 (-509C/T rs2243250), MIF (-173G/C, rs755622), IFNG (+874T/A rs2430561), IL17A (SNP G197A/G, rs2275913), IL17F (T7488C/T, rs763780) and TGFβ1 (codon 10 or +869T/C/G rs1800470). Two targets were elected (TNFA SNP -308G/A, rs1800629 and IL10 SNP -1082G/A, rs1800896) for the identification of these SNPs in the study population. It was not found evidences of association of these polymorphisms with the susceptibility of developing CD. Nonetheless, a Chi-square value closely to the significance level (Borderline 5%) was observed (X2= 3,742 and p=0,053), suggesting a tendency of TNFA association with CD risk. Together, these findings reinforce the concept that the interplay between host/parasite is essential for CD development, as well as for the disease epidemiology