As análises realizadas por laboratórios de microbiologia de alimentos exercem um importante papel no suporte às ações da Vigilância Sanitária. Materiais de referência (MR) e materiais de referência certificados (MRC) são considerados ferramentas fundamentais no acompanhamento do desempenho analítico. O uso de MR microbiológicos no controle interno de ensaios analíticos é inquestionável e recomendado pelos principais manuais de métodos microbiológicos oficiais. No Brasil, as cepas de referência utilizadas como controle interno de ensaios são obtidas de provedores internacionais. Os altos custos para aquisição e os requisitos, burocráticos e sanitários, para a importação de materiais biológicos dificultam sua aquisição. Uma alternativa para tornar a utilização das cepas de referência importadas mais acessíveis aos laboratórios brasileiros têm sido a replicação e o fornecimento como cepas derivadas. Contudo, tais ações podem ser comprometidas por regras impostas por provedores, assim como, por barreiras relacionadas à biossegurança no mercado internacional. Assim, é clara a necessidade do país em investir no estudo e desenvolvimento desses materiais. O objetivo deste trabalho foi estabelecer três MRC microbiológicos, com estirpes isoladas de alimentos, de acordo com as normas técnicas oficiais de produção e controle. A partir do uso das metodologias do MALDI-TOF e do MLST, foram obtidos perfis proteômicos e moleculares que auxiliaram na seleção das estirpes utilizadas na elaboração dos MR. Foram produzidos três lotes candidatos à bactéria de referência (CBR) de Salmonella Typhimurium, Escherichia coli e Listeria monocytogenes. Os materiais foram aprovados quanto à pureza, viabilidade, homogeneidade e estabilidade. Foram identificados fenotipicamente, genotipicamente e caracterizados molecularmente pelas metodologias do MLST e ERIC-PCR. Os CBR foram testados na rotina de ensaios de dois laboratórios de saúde pública. Os lotes foram também caracterizados pelo sequenciamento de genes espécie específicos. Os lotes de Salmonella e de L. monocytogenes foram certificados qualitativamente. O CBR de E. coli foi caracterizado quantitativamente, porém não foi certificado por apresentar na caracterização qualitativa molecular índice de identidade de 92% na sequência de nucleotídeos do gene uspA com sequências do banco de dados do GenBank.The analyzes carried out by food microbiology laboratories play an important role in supporting the actions of Sanitary Surveillance. Certified reference materials (RM) and certified reference materials (CRM) are considered key tools in monitoring analytical performance. The use of microbiological reference materials in the internal control of analytical assays is unquestionable and recommended by the main official manuals of microbiological methods. In Brazil the reference strains used for internal control of assays are of international origin. An alternative to making the use of imported reference strains more accessible to Brazilian laboratories has been replication and delivery as derived strains. Thus, it is clear the country's need to invest in the study and development of these materials. The aim of this work was to establish three batches of microbiologic CRM, with strains isolated from food, according to the official technical standards of production and control. From the use of the MALDI-TOF and MLST methodologies, were obtained proteomic and molecular profiles that aided the selection of the strains used in the elaboration of MR. Three RBC of Salmonella Typhimurium, Escherichia coli and Listeria monocytogenes were produced. Were identified phenotypically, genotypically and molecularly characterized by MLST, ERIC-PCR and tested in the routine of two public health laboratories. Materials were also characterized by the sequencing of specific species genes. The batches of Salmonella and L. monocytogenes were qualitatively certified. E. coli RBC was quantitatively characterized but was not certified to present a 92% identity index on the nucleotide sequence of the uspA gene with sequences from the GenBank database.