O transplante hepático permanece como o único tratamento eficaz disponível para hepatopatias graves. Entretanto, fatores como a escassez de órgãos viáveis e a rejeição imunológica limitam significativamente este tipo de terapia. O transplante de hepatócitos é uma opção terapêutica em estudo, contudo, a perda de funções metabólicas após técnicas convencionais de cultivo e a inabilidade de proliferar in vitro impedem a reprodução em larga escala deste tipo de procedimento. Devido a estes fatores, uma fonte extra e autóloga de hepatócitos poderia suprir essa carência. Estudos recentes apresentam as células-tronco mesenquimais (CTM) como uma fonte promissora de células hepáticas a partir de reprogramação direta com superexpressão de fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento embrionário hepático. OBJETIVO: O presente estudo visou estabelecer um protocolo para geração de células semelhantes a hepatócitos, do ponto de vista morfológico,fenotípico e funcional, através da reprogramação direta de CTMs. MÉTODOS: A reprogramação hepática foi induzida a partir da superexpressão dos fatores de transcrição FOXA2 e HNF4α através de sistema lentiviral de segunda geração e cultivo das CTM modificadas em meio de indução da diferenciação hepática contendo fatores como HGF, FGF-4 e EGF. As células reprogramadas foram caracterizadas fenotipicamente, ultra-estruturalmente e seu perfil de expressão gênica e propriedades funcionais foram avaliados. Protocolos utilizando cell sorting e pequenas moléculas foram estabelecidos para purificação e maturação da linhagem celular reprogramada. RESULTADOS: Após o cultivo em meio de indução da diferenciação hepática, foi observada a presença de colônias com morfologia epitelial característica de células que expressam marcadores de hepatócitos adultos, tais como albumina,tirosina aminotransferase (TAT) e alfa-1-antitripsina (AAT). A linhagem também apresentou características funcionais como capacidade de estocar glicogênio, lipídios, captação e depuração de indocianina verde, assim como expressão e atividade de enzimas do complexo citocromo P450. A análise ultraestrutural demonstrou características citoplasmáticas semelhantes às de hepatócitos primários como por exemplo o montante de conteúdo mitocondrial. A diferença de conteúdo mitocondrial entre células reprogramadas e CTM foi utilizada para purificação da linhagem por cell sorting. Após a etapa de maturação, foi observada o surgimento de células com aspecto de hepatócitos primários e de células com perfil de colangiócitos. CONCLUSÃO: O protocolo de reprogramação hepática direta desenvolvido mostrou-se eficiente e robusto, gerando células com propriedades hepáticas funcionais que podem ser utilizadas em plataformas de testes de toxicidade de drogas, estudos do desenvolvimento hepático, além de abrir perspectivas de novas alternativas terapêuticas para hepatopatias crônicas e agudas.O presente trabalho foi realizado como o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. CNPq. FINEP e FAPESB.INTRODUCTION: The liver transplantation remains the only effective treatment available for advanced liver diseases. Although, factors such as a shortage of viable organs and immune rejection significantly limit this type of therapy. The transplantation of hepatocytes is a therapeutic option in study, however, the loss of metabolic functions after conventional cultivation techniques and the inability to proliferate in vitro prevent large-scale reproduction of this type of procedure. Due to these factors, an extra source of autologous hepatocytes could address this need. Recent studies show the mesenchymal stem cells (MSC) as a promising source of liver cells from direct reprogramming by overexpression of transcription factors involved in the embryonic liver development. OBJECTIVE: The present study aims to establish a protocol for generation of hepatocyte-like cells, from the morphological, phenotypic and functional point of view, by direct reprogramming of mesenchymal stem cells (MSC). METHODS: The hepatic reprogramming process was induced by overexpression of the transcription factors FOXA2 and HNF4α through a second-generation lentiviral system and culture of the modified CTM in hepatic differentiation medium containing factors such as HGF, FGF-4 and EGF. The reprogrammed cells were characterized phenotypically and ultrastructurally, and their gene expression profile and functional properties were evaluated. Protocols using cells sorting and small molecules were stablished for purification and maturation of the hepatocyte-like cell line generated. RESULTS: After culture in hepatic differentiation medium, we observed the presence epithelial-like cells, expressing adult hepatocyte markers, such as albumin, tyrosine aminotransferase (TAT) and alpha-1-antitrypsin (AAT). The cell lineage also presented functional characteristics such as capacity to store glycogen, lipids, uptake and clearance of indocyanine green, as well as expression and activity of cytochrome P450 enzymes complex. Ultrastructural analysis demonstrated cytoplasmic characteristics similar to those of primary hepatocytes, as the amount of mitochondrial content. The difference of mitochondrial content between reprogrammed cells and MSC was used for purification of the lineage by cell sorting. After the maturation stage, the emergence of cells with the appearance of primary hepatocytes and cholangiocyte-like cells was observed. CONCLUSION: The direct hepatic reprogramming protocol developed was efficient and robust generating cells with functional liver properties that can be used in drug toxicity testing platforms, liver development studies and open perspectives of new therapeutic alternatives for chronic and acute liver diseases.