A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é a segunda causa de morte no mundo em crianças de 0 a 4 anos de idade. No tratamento da LLA emprega-se a enzima LAsparaginase (L-ASP) do tipo II, por possuir maior afinidade com seu substrato LAsparagina (L-Asn). Os medicamentos comerciais utilizados atualmente derivam de Escherichia coli ou de Erwinia chrysanthemi. À diferença das células normais, alguns subtipos de células LLA são incapazes de sintetizar L-Asn, pela perda da expressão da enzima asparagina sintetase (AS). A L-ASP é uma hidrolase que converte o substrato L-Asn em aspartato e amônia na presença de água. Quando administrada eficazmente, a enzima leva a uma diminuição do substrato no meio extracelular, à apoptose seletiva das células do tipo LLA e a uma cura definitiva de 80 a 90% das crianças e de 30 a 60% dos jovens e adultos. Porém, tais L-ASPs também apresentam atividade glutaminase, o que leva à diminuição da L-Glutamina (L-Gln) no sangue periférico ocasionando efeitos adversos no paciente, como pancreatite e problemas neurológicos. Observam-se também outros efeitos adversos causados por respostas imunológicas que podem levar à inativação da enzima e / ou a reações anafiláticas e, consequentemente, à parada ou modificação do tratamento, reduzindo assim a sobrevida dos pacientes. Por outro lado, vale ressaltar que atualmente no Brasil o acesso ao medicamento está muito dificultado devido ao desabastecimento, embora a L-ASP encontra-se listada entre os 10 produtos prioritários para o Sistema Único de Saúde (SUS) Os objetivos do trabalho foram estudar as características físico-químicas e biológicas e preparar uma base tecnológica para a engenharia genética de L-ASPs micobacterianas, incluindo a sua eventual expressão em um sistema alternativo Para isso, propomos o estudo das LASPs nativas de Mycobacterium smegmatis mc2155 (mc2155) e de 3 isolados micobacterianos da Coleção de Bactérias da Mata Atlântica (CBMA) (271, 293 e 294), em termos de caracterização e atividade enzimática. Para tal fim, as diferentes sequências foram amplificadas e clonadas no plasmídeo pET28a, que apresenta origem de replicação reconhecido por E. coli. Além disso, o gene da L-ASP derivado de mc2155 também foi clonado no plasmídeo pUS976, que apresenta origem de replicação reconhecido tanto por E. coli como por micobactérias, visando obter a produção da proteína de interesse de forma secretada para facilitar o processo de purificação. As construções obtidas com pET28a foram expressas em E. coli BL21(DE3) e as obtidas com pUS976 foram expressas em mc2155. Seguidamente foi realizada a indução da expressão das proteínas de interesse. Observou-se maior produção das L-ASPs derivadas de mc2155 e de 271 a temperatura ambiente após 24 horas e a 37 oC após 16 horas, respectivamente, em meio auto-induzível livre de glicose. Por outro lado, foi realizada uma modelagem comparativa da L-ASP de mc2155 empregando várias técnicas e foram identificados os resíduos do sítio catalítico. O trabalho desenvolvido fornece a base para posteriores estudos da atividade asparaginase e glutaminase e para a síntese de uma nova L-ASP otimizada e derivada da L-ASP nativa de mc2155, visando a redução ou eliminação de epítopos imunogênicos, a diminuição da atividade glutaminase e o aumento da atividade asparaginase.Acute Lymphoid Leukemia (ALL) is the second leading cause of death worldwide in children of 0 to 4 years old. In the treatment of ALL, the enzyme L-Asparaginase (LASP) type II is used, due to the higher affinity with its substrate L-Asparagine (L-Asn). Commercial drugs currently used derive from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi. Unlike normal cells, some subtypes of ALL cells are unable to synthesize L-Asn, due to the loss of expression of the enzyme asparagine synthetize (AS). L-ASP is a hydrolase, which converts the L-Asn substrate into aspartate and ammonia in the presence of water. When administered efficiently, the enzyme leads to a decrease of the substrate in the extracellular medium, selective apoptosis of ALL-type cells and a definitive cure of 80 to 90% of children and 30 to 60% of youngsters and adult. However, such L-ASPs also have glutaminase activity, which leads to a decrease in L-Glutamine (L-Gln) in the peripheral blood causing adverse effects on the patient, such as pancreatitis and neurological problems. Other adverse effects caused by immune responses that may lead to inactivation of the enzyme and / or anaphylactic reactions and, consequently, to stopping or modifying the treatment, lead to a reduction in patient survival. It is worth mentioning that currently in Brazil access to the drug is unavailable, so L-ASP is listed among the 10 priority products for the Health Unic System The objective of this work was to study the physicochemical and biological characteristics and to prepare a technological basis for the genetic engineering of mycobacterial L-ASPs, including their eventual expression in an alternative system. For this, we propose the study of native Mycobacterium LASPs smegmatis mc2155 (mc2155) and 3 mycobacterial isolates from the Coleção de Bactérias da Mata Atlântica (CBMA) (271, 293 and 294) in terms of characterization and enzymatic activity. To this end, the different sequences were amplified and cloned into plasmid pET28a, which has origin of replication recognized by E. coli. In addition, the L-ASP gene derived from mc2155 was also cloned into plasmid pUS976, which shows origin of replication recognized by both E. coli and mycobacterias, in order to obtain the production of the secreted protein of interest to facilitate the purification. Constructs obtained with pET28a were expressed into E. coli BL21 (DE3) and those obtained with pUS976 were expressed into mc2155. Induction of expression of the proteins of interest was then performed. A higher production of L-ASPs derived from mc2155 and 271 at room temperature was observed after 24 hours and at 37 oC after 16 hours, respectively, in self-inducible glucose-free medium. Additionally, a comparative modeling of the L-ASP of mc2155 was performed employing various techniques, and catalytic site residues were identified. This work developed provides the basis for further studies of asparaginase and glutaminase activity and for the synthesis of a new and optimized L-ASP derived from native mc2155 L-ASP, aiming at the reduction or absence of immunogenic epitopes, the decrease of glutaminase activity and the increase of asparaginase activity.