A esporotricose, micose subcutânea causada pelo complexo Sporothrix schenckii, é cosmopolita e a mais frequente na América Latina. Nos últimos anos tem aumentado significativamente o número de casos no Brasil, com destaque para o aumento no estado do Rio de Janeiro. Atualmente, quatro novas espécies dentro do gênero Sporothrix têm sido consideradas, sendo essas: Sporothrix brasiliensis, Sporothrix globosa, Sporothrix mexicana e Sporothrix luriei, as quais são altamente associadas às duas espécies já existentes S. schenckii e S. albicans, sendo a última recentemente renomeada com o S. pallida . A caracterização destas espécies foi realizada por meio da utilização de provas fenotípicas: morfologia de conídios, teste de crescimento à 30ºC e 37ºC , teste de termotolerância, auxonograma e sequenciamento parcial do gene da calmodulina . O princ ipal objetivo deste estudo foi a caracterização de espécies do complexo Sporothrix por meio de taxonomia molecular através do desenvolvimento de metodologia baseada em ácidos nucléicos para a identificação das espécies e a determinação do perfil proteômico do complexo Sporothrix , utilizando metodologia baseada em espectrometria de massa em célula intacta (MALDI - TOF ICMS). No presente trabalho foi realizada a identificação em nível de espécie de isolados clínicos e ambientais oriundos da epidemia de esporotr icose no Rio de Janeiro, de um surto zoonótico familiar no e stado do Espírito Santo e dois isolados clínicos oriundos de Portugal. Por meio da identificação por taxonomia polifásica de 246 isolados clínicos e um ambiental obtidos da en demia de esporotricos e no Estado do Rio de Janeiro foi demonstrado que esta abordagem é fundamental para a identificação das espécies do complexo Sporothrix A identificação em nível de espécies d e cepas d o complexo Sporothrix spp. provenientes de diferentes regiões geográficas, demonstrou S. globosa e S. mexicana circulando em Portugal, sugerindo que a esporotricose seja subdiagnosticada naquele país, e que esta micose poderia ser considerada emergente no sul da Europa. Também descrevemos o pri meiro surto causado por S. brasiliensis fora da zona endêmica do Rio de Janeiro. Para a identificação das espécies de Sporothrix descrevemos uma PCR fingerprinting utilizando o primer universal T3B, o qual distinguiu com sucesso as espécies S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana, e S. schenckii. Essa metodologia gerou padrões de bandas distintos, permitindo a correta identificação de todos os 35 isolados clínicos estudados apresentando 100% de concordância com o sequenciamento parcial do gene da calmoduli na , sendo uma técnica rápida e de fácil execução. A padronização da metodologia do MALDI - TOF ICMS, p ossibilit ou a determinação de perfis proteômicos distintos entre as espécies do complexo Sporothrix , demostrando a aplicabilidade desta técnica na diferenciação das espécies. A caracterização de espécies do complexo Sporothrix em nosso estudo foi a maior reportada na literatura especializada até o presente. Concluimos que a taxonomia polifásica é fundamental para diferenciação das espécies de Sporothrix, podendo ser realizada com as técnicas de T3B Fingerprinting e MALDI - TOF ICMS, tendo importância na epidemiologia e clínica da esporotricoseSporotrichosis, a subcutaneous mycosis caused by the Sporothrix schenckii complex, has a worldwide distribution and is frequent in Latin America. In last years, the number of cases has been significantly increased in Brazil, especially in Rio de Janeiro state. Recently, four new species, in Sporothrix genus have been considered, these species are: Sporothrix brasiliensis, Sporothrix globosa, Sporothrix mexicana, and Sporothrix luriei which are highly associated to the two existing species S. schenckii and Sporothrix albicans that has been recently renamed as Sporothrix pallida. The characterization of these species was performed by the use of phenotypic tests: morphology of conidia, growth rates at 30ºC and 37ºC, thermotolerance, carbohydrate assimilation tests and partial sequencing of the calmodulin gene. The main goal of this study was the characterization of species of Sporothrix complex by molecular taxonomy, through the development of methodology using nucleic acids for identification of species and determination of proteomic profile of Sporothrix using a method based on intact cell mass spectrometry (MALDI-TOF ICMS). In the present work the identification to the species level of clinical and environmental isolates originating from the sporotrichosis endemic in Rio de Janeiro, from an outbreak of zoonotic sporotrichosis in Espírito Santo, and two clinical isolates from Portugal was performed. Through identification by polyphasic taxonomy of 246 clinical isolates and one environmental isolate obtained form the endemic sporotrichosis in Rio de Janeiro state, it has been shown that this approach is essential to identify the species of the Sporothrix complex The identification at species level of strains from the Sporothrix spp. complex from different geographic regions demonstrated S. globosa and S. mexicana circulating in Portugal, suggesting that sporotrichosis should be under diagnosed in that country and that this mycosis could be considered as an emerging mycosis in southern Europe. We also describe the first outbreak caused by S. brasiliensis outside the endemic zone of Rio de Janeiro. To identify the species of Sporothrix we describe a PCR fingerprinting using the universal primer T3B which distinguished successfully the species S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana, and S. schenckii. This methodology has generated different band patterns allowing the correct identification of all 35 clinical isolates studied with 100 % of concordance with partial sequencing of the calmodulin gene, being a methodology fast and easy to apply. The standardization of MALDI-TOF ICMS technique allowed the determination of distinct proteomic profiles between different species of Sporothrix, demonstrating the feasibility of this technique in the differentiation of species. The speciation of Sporothrix complex in this study was the largest reported in the specialized literature up to now. We conclude that the polyphasic taxonomy is essential for differentiation of Sporothrix species and could be performed with the techniques of T3B fingerprinting and MALDI - TOF ICMS, having importance in the epidemiology and clinics of sporotrichosis