Dissertation
Análise de desempenho de mosquitos Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) transgênicos expressando a fosfolipase A2 mutada do veneno de abelhas
Registro en:
SANTOS, Maíra Neves. Análise de desempenho de mosquitos Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) transgênicos expressando a fosfolipase A2 mutada do veneno de abelhas. 2008. 84 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)-Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)-Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2008.
Autor
Santos, Maíra Neves
Resumen
A manipulação genética de insetos é uma alternativa às formas usuais de interferência, como por exemplo, o uso de inseticidas. Utilizando esta ferramenta podemos inserir, em insetos, genes que possuem a capacidade de bloquear parasitas. Estudos mostraram que a proteína fosfolipase A2 (PLA2) de venenos animais inibia a formação de oocistos de espécies de Plasmodium, se tornando uma ótima candidata para expressão em mosquitos transgênicos a fim de reduzir a transmissão do parasita. Contudo, ao expressar a PLA2 em mosquitos, observou-se
que o desempenho biológico dos insetos foi prejudicado. A fim de contornar esse problema foram realizadas mutações no sítio ativo da enzima inativando-a, sem alterar sua capacidade de bloqueio de desenvolvimento de parasitas. Essa molécula de bloqueio (PLA2m) foi expressa em Aedes fluviatilis, vetor em laboratório do parasita causador da malária de aves. Ensaios prévios de avaliação de inibição do parasita e caracterização molecular das linhagens transgênicas (4T, 8T, 9T e 10T) não confirmaram se a PLA2m prejudicava o desempenho dos mosquitos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho biológico destes mosquitos. Fêmeas da linhagem 8T apresentaram longevidade significativamente maior que o controle; em machos, a longevidade das linhagens 8T, 9T e 10T foi maior que a do controle. A fecundidade das fêmeas transgênicas foi igual à das fêmeas do grupo controle,
porém a fertilidade das linhagens 4T, 8T e 10T foi menor (em porcentagem) que a do controle. A freqüência do transgene se manteve alta por várias gerações,mostrando que o mosquito transgênico se mantém persistente. Houve desvios de razão sexual nos transgênicos, quase sempre para maior proporção de machos. Não houve diferença significativa na susceptibilidade ao inseticida organofosforado Temefós entre as linhagens transgênicas e controle. Com relação à atividade das enzimas que detoxificam inseticidas, apenas a linhagem 4T apresentou atividade de acetilcolinesterase parcialmente alterada em relação ao controle. Entretanto, as outras linhagens mantiveram-se sensíveis. Para a alfa, beta e PNPA esterases, oxidases de função mista e glutationa S-transferase, todas as linhagens transgênicas mantiveram-se sensíveis. Podemos concluir que a PLA2m não interferiu nos parâmetros biológicos avaliados nos mosquitos transgênicos. Estes resultados a colocando como uma forte candidata para ser expressa em mosquitos anofelinos
vetores de parasitas da malária humana. The genetic manipulation of insects may be an alternative to usual control
methods, as the insecticide application. By this technique, we can insert parasite blocking genes that reduce or block transmission by vectors. Previous studies have shown that animal venom phospholipase A2 (PLA2) proteins could inhibit Plasmodium oocyst formation, making them ideal candidates to be expressed in transgenic mosquitoes to reduce parasite transmission. However, when these mosquitoes expressed the bee venom protein PLA2, it indeed inhibited the parasites significantly, but also decreased the fitness of mosquitoes. To overcome this problem, a mutation
in the PLA2 gene active site was performed, inactivating the enzyme (mPLA2), although maintaining its blocking ability. We obtained four transgenic Aedes fluviatilis lines expressing the. Parasite inhibition assays and molecular characterization were performed with these mosquitoes, but whether mPLA2 expression impaired their fitness could not be confirmed. This work aimed to study the fitness of the mPLA2 transgenic mosquitoes and their susceptibility to insecticides. We found that the longevity of 8T females was higher than that of control females. Besides the 8T, 9T and 10T males also showed similar alterarions, whereas there were none observed
for the other lines. Female fecundity was not altered, but fertility of some lines was lower (in percentage) than in controls. The transgene frequency was kept high for many generations, showing that transgenic mosquitoes are stable. Moreover, there were deviations on the sexual ratio of transgenic lineages, often with a higher proportion of males. No significant differences on organophosphate (Temephos) susceptibility were found between transgenic and control lines. The quantification of the activity of insecticide detoxifying enzymes showed no significant differences, whereas line 4T showed partial altered activity in comparison to the control; all other
lines were maintained in the category of susceptible population to this enzyme. For the alpha, beta and PNPA esterases, mixed function oxidases and glutathione Stransferase, all the transgenic lines were characterized as susceptible. We can conclude that the mPLA2 does not interfere with the fitness of transgenic mosquitoes, being therefore a strong candidate to be expressed in anopheline mosquitoes, vectors that transmit human malaria parasites.