O processo de invasão do Plasmodium vivax aos reticulócitos é complexo, essencial para o sucesso da infecção e coincide com o aparecimento dos sintomas clínicos da doença. Portanto, proteínas envolvidas nesse processo constitui alvos no desenvolvimento de uma vacina contra P. vivax. Recentemente estudos têm demonstrado que a combinação de múltiplos antígenos tem efeito protetor contra a doença em mais de 90%, dos quais incluem a Duffy binding protein II (DBPII) e a recém descrita Erythrocyte Binding Protein (EBP2), uma proteína paráloga da DBPII. No entanto, o efeito protetor conferido pela associação DBPII/EBP2 foi observado apenas para variante homóloga da DBPII. Para contornar o efeito da diversidade genética de DBPII sobre o sistema imune, o imunógeno sintético baseado na DBPII, denominado de DEKnull-2, foi construído para induzir anticorpos capazes de bloquear a interação entre diferentes alelos DBPII e seu receptor cognato em reticulócitos, o qual, tem mostrado resultados promissores. Buscando contribuir no desenvolvimento de uma vacina, o conhecimento sobre a aquisição e longevidade da resposta imune naturalmente adquirida para DEKnull-2 e EBP2, bem como o estabelecimento de células B de memória (MBCs) de longa duração são necessários. Com a vantagem de estudar uma população exposta uma única vez a um surto de malária causado por P. vivax fora da região endêmica brasileira, numa primeira etapa, avaliamos a aquisição e longevidade da resposta de anticorpos IgM e IgG contra as EBP2, DBPII e DEKnull-2, e a proteína bem caracterizada e imunogênica MSP1-19. Para isso, realizamos um acompanhamento de 12 meses dos indivíduos expostos (16 casos e 22 não caso) em quatro cortes transversais com intervalo de 3 meses. Os nossos resultados mostram que uma única exposição ao P. vivax não foi suficiente para induzir níveis relevantes de IgM ou IgG contra EBP2, DBPII ou DEKnull-2. No entanto, após infecções de P. vivax recorrentes houve um aumento expressivo na resposta de IgG contra DBPII e DEKnull-2, sendo essa resposta estável para DEKnull-2 ao longo de 12 meses. Polimorfismo no gene ebp2 não parece explicar a baixa resposta de anticorpos contra EBP2, uma vez o isolado de P. vivax do surto mostrou alta identidade com o isolado referência (proteína recombinante utilizada nos ensaios sorológicos). Embora pouco imunogênica em indivíduos expostos uma única vez ao P. vivax, a EBP2 foi altamente imunogênica em indivíduos com longa exposição à malária, com frequência de respondedores que variaram de 35% a 92%, dependendo do número de episódios de malária. Na segunda etapa, avaliamos a longevidade da resposta de células B de memória (MBCs) contra DBPII e DEKnull-2 após 13 anos a ocorrência do surto de malária. Apesar dos anticorpos antígeno-específicos contra P. vivax não serem detectados após 13 anos da única exposição, MBCs antígeno-específicas ainda foram detectadas. Especificamente, 44% dos indivíduos caso apresentaram MBCs diferenciadas em células secretoras de anticorpos (ASCs) específicas para DEKnull-2 e 33% para DBPII. Além disso, a resposta de ASCs para DEKnull-2 teve maior amplitude comparada com a DBPII. Uma análise de correlação dos dados de sorologia IgM e IgG com o perfil de subpopulações de células B mostrou correlação positiva com anticorpos contra DBPII e MBCs atípicas enquanto para DEKnull-2 a correlação foi significativa com as MBCs clássicas. Em conjunto, o presente trabalho mostra que a EBP2 apesar de pouco imunogênica após uma breve exposição ao P. vivax, é altamente imunogênica em indivíduos com longa exposição à malária. Além disso, nossos resultados reforçam o potencial da DEKnull-2 como um importante candidato vacinal contra o P. vivax.CAPES NIH CNPq FAPEMIG Programa de Excelência em Pesquisa do IRR/ FIOCRUZPlasmodium vivax blood-stage invasion process into reticulocytes is complex, critical for parasite development, and associated with clinical disease. Therefore, blood-stage proteins are targets for vaccine development against P. vivax. Recently, studies have been demonstrated that combination of multiple P. vivax proteins showed strong protective effect (>90%), including Duffy binding protein II (DBPII) and novel Erythrocyte Binding Protein (EBP2), a DBPII paralog. However, the association of DBPII/EBP2 was found only against a homologous DBPII allele. To overcome the genetic diversity of the DBPII, the engineering vaccine DEKnull-2 was constructed to induce inhibitory antibodies able to block the interaction between different DBPII allele and its cognate receptor on DARC positive reticulocytes, that it has showed promised results. Thus, the understanding of acquisition and longevity of natural immune response against DEKnull-2 and EBP2, as well as the generation of long-term memory B cells (MBCs) response are necessary for development of an effective vaccine against P. vivax. Here, we took advantage of a small outbreak of P. vivax malaria, located in a non-endemic area of Brazil, firstly, we investigated the acquisition and longevity of IgM/IgG antibodies against EBP2, DBPII, DEKnull-2, and well-characterized and imumunogenic MSP1-19, among individuals who had their first and brief exposure to P. vivax. In the outbreak area, the experimental approach included 4 cross sectional surveys at 3-month interval (12-month follow-up) including exposed individuals (16 cases, and 22 non-cases). The results demonstrated that while a brief initial P. vivax infection was not efficient to induce IgM/ IgG antibodies to EBP2, DBPII or DEKnull-2, IgG antibodies against DBPII and DEKnull-2 (but not EBP2) were boosted by recurrent blood-stage infections, with a stable IgG response against DEKnull-2 within 12 months. Polymorphism in the ebp2 gene does not seem to explain EBP2 low immunogenicity as the ebp2 allele associated with P. vivax outbreak presented high identity to the original EBP2 isolate used as recombinant protein. Although EBP2 antibodies were barely detectable after a primary episode of P. vivax infection, EBP2 was highly recognized by long-term malaria-exposed Amazonian range from 35% to 92% according to previous malaria episodes. In the next step, we evaluated the longevity of MBCs response to DBPII and DEKnull-2 after 13 years of the outbreak. Although the antigen-specific antibodies did not detect 13-years after a single and brief P. vivax exposure, MBCs were detected. Specifically, 44% of case individuals showed the differentiation of MBCs in antibody secreting cells (ASCs) for DEKnull-2, and 33% for DBPII. The higher levels of ASCs were observed for DEKnull-2 than DBPII. Correlation analysis between IgM/IgG specific-antibodies and MBCs subset showed a positive correlation between antibodies against DBPII and atypical MBCs, while DEKnull-2 antibodies positively correlated with classical MBCs. Taken together, our results showed EBP2 was poor immunogenic after a single and brief P. vivax exposure, but it is highly immunogenic after long-term malaria exposure. Furthermore, our results highlighted the potential of DEKnull-2 as a vaccine candidate.