Dissertation
Estudo da interação entre Trypanosoma caninum e células macrofágicas: aspectos morfológicos, biológicos e ultraestruturais
Registro en:
NASCIMENTO, Kátia Cristina Silva. Estudo da interação entre Trypanosoma caninum e células macrofágicas: aspectos morfológicos, biológicos e ultraestruturais. 2020. 146 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2020.
Autor
Nascimento, Kátia Cristina Silva
Resumen
Trypanosoma caninum é um tripanosomatídeo até então isolado apenas da cultura de pele íntegra de cães. No cultivo axênico apresenta as formas evolutivas: epimastigota aflagelar e flagelar, tripomastigota e esferomastigota. Inúmeros aspectos sobre T. caninum ainda precisam ser investigados, dentre eles em relação ao potencial infectivo das formas evolutivas. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar aspectos morfológicos, biológicos e utraestruturais da interação de T. caninum com células macrofágicas in vitro. Inicialmente, foi realizada curva de crescimento, análise e quantificação das formas evolutivas de T. caninum em meio axênico e em cocultivo com a linhagem celular DH82. Em seguida, foi realizada análise ultraestrutural das formas de T. caninum cultivadas em meio axênico e cocultivo com linhagem celular DH82. Com intenção de conhecer o potencial infectivo da forma epimastigota aflagelar foi realizado estudo de interação T. caninum com a linhagem de macrófago canino DH82 e macrófago peritoneal (M\0278) de camundongos BALB/c, em duas condições: em meio DMEM F12 suplementado com SFB e a outra com meio suplementado com BSA. Toda cinética ocorreu em 7 tempos: 15, 30 e 45 minutos e 2, 6 ,24 e 48 horas. A análise da interação foi realizada por microscopia óptica de campo claro (MCC), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET). Para análise quantitativa e estatística foram contabilizados total de células infectadas, com parasitos aderidos e parasitos interiorizados por células infectadas. A curva de crescimento de T. caninum em meio axênico e em cocultivo apresentaram o mesmo perfil, porém no meio axênico foi observada no pico da fase exponencial quase quatro vezes mais parasitos que no cocultivo. Diferente do cultivo axênico, no qual foi observada apenas as formas epimastigotas, durante o cocultivo com a linhagem celular DH82 foi observada diferenciação para forma tripomastigota e esferomastigota. A análise ultraestrutural demonstrou que T. caninum possui estruturas descritas para as espécies de tripanosomatídeos, com destaque para inúmeros corpúsculos lipídicos ao longo do corpo. Em relação a interação T. caninum-macrófagos foram obtidos resultados inéditos: T. caninum é capaz de infectar células, a forma epimastigota aflagelar é infectiva para macrófagos e foi verificada a existência de formas amastigotas de T. caninum. Já no tempo de 15 minutos, a forma epimastigota aflagelar de T. caninum adere e entra nas células, rapidamente, modifica-se para a forma amastigota dentro do vacúolo parasitóforo. Dentro deste vacúolo ocorre divisão de amastigotas. Algumas amastigotas são digeridas pelas células e outras viáveis são liberadas, como observado por MET nos tempos de 45 minutos em interação com M\0278 e no tempo de 6 horas na interação com a linhagem DH82. No meio extracelular, em algumas amastigotas ocorre mudança para epimastigota aflagelar e outras interagem com a célula para reinfecção. Foi observada diferença significativa em relação a infecção entre as duas células e em relação a células nas quais ocorriam adesão e infecção simultaneamente na condição com SFB. Esta dissertação apresenta resultados inéditos sobre o conhecimento dos eventos ocorridos durante a interação T. caninum-células que são úteis no entendimento sobre aspectos biológicos e da relação parasito-hospedeiro. Trypanosoma caninum is a trypanosomatid hitherto isolated only from the culture of intact dog skin. In axenic cultivation it presents the evolutionary forms: aflagellar and flagellar epimastigote, trypomastigote and spheromastigote. Several aspects about T. caninum still need to be investigated, among them in relation to the infectious potential of evolutionary forms. In this context, the objective of this study was to evaluate morphological, biological and ultrastructural aspects of the interaction of T. caninum with macrophage cells in vitro. Initially, a growth curve, analysis and quantification of the evolutionary forms of T. caninum were performed in axenic medium and in co-cultivation with the cell line DH82. Then, an ultrastructural analysis of the forms of T. caninum cultivated in axenic and co-cultured media with cell line DH82 was performed. With the intention of knowing the infectious potential of the aflagellar epimastigote form, a T. caninum interaction study was performed with the canine macrophage DH82 and peritoneal macrophage (M\0278) strain of BALB / c mice, under two conditions: in DMEM F12 medium supplemented with FBS and the other with medium supplemented with BSA. All kinetics occurred in 7 times: 15, 30 and 45 minutes and 2, 6, 24 and 48 hours. The interaction analysis was carried out by light field optical microscopy, scanning electron microscopy (SEM) and transmission (TEM). For quantitative and statistical analysis, total infected cells were counted, with adherent parasites and parasites internalized by infected cells. The growth curve of T. caninum in axenic and co-cultured environments showed the same profile, but in the axenic environment, at the peak of the exponential phase, almost four times more parasites were observed than in co-cultivation. Unlike axenic culture, in which only epimastigote forms were observed, during co-cultivation with the DH82 cell line, differentiation into trypomastigote and spheromastigote forms was observed. The ultrastructural analysis showed that T. caninum has structures described for the trypanosomatid species, with emphasis on numerous lipid corpuscles throughout the body. Regarding the T. caninum-macrophage interaction, unprecedented results were obtained: T. caninum is capable of infecting cells, the aflagellar epimastigote form is infectious for macrophages and the existence of amastigote forms of T. caninum was verified. Within 15 minutes, the aflagellar epimastigote form of T. caninum adheres and enters the cells, quickly changes to the amastigote form within the parasitophore vacuole. Within this vacuole there is a division of amastigotes. Some amastigotes are digested by cells and others viable are released, as observed by TEM in 45 minutes in interaction with M\0278 and in 6 hours in interaction with the DH82 strain. In the extracellular environment, in some amastigotes there is a change to aflagellar epimastigote and others interact with the cell for reinfection. A significant difference was observed in relation to infection between the two cells and in relation to cells in which adhesion and infection occurred simultaneously in the condition with FBS. This dissertation presents unprecedented results on the knowledge of the events that occurred during T. caninumcell interaction that are useful in understanding biological aspects and the parasite-host relationship.